Original paper

Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis with specially purified total DNA of Fucus vesiculosus L., F. serratus L. and F. spiralis L.

Tesmer, Jens; Miethke, Marcus; Conrad, Klaus

Abstract

The seaweed species of Fucus are rather poorly suited for RAPD investigations because they have a high content of special polysaccharides and of polyphenolic derivatives. From diploid tissue of Fucus serratus, F. vesiculosus and F. spiralis as well as from two other brown algae, Ascophyllum nodosum (L.) Le Jolis and Laminaria digitata (Huds.) Lamour., total DNA was isolated by different methods, which removed secondary compounds to various extents. The favoured innovative isolation method combining two kits with some additional purification steps yielded DNA which was successfully analysed by RAPD technique with two decameric primers. Among the different individuals of each species the resulting banding patterns were nearly identical, even if the concentration of isolated seaweed DNA (2 ng/15 μl reaction volume) was reduced by two tenfold dilution steps, which is considered to be a key indicator of sufficient quality and quantity of template DNA (McClelland & Welsh 1994). Moreover, the statistical analysis of banding patterns, which was performed by the neighbor-joining cluster method using the similarity index of Nei (1972), revealed the following pattern of genetic diversity: F. spiralis and F. vesiculosus were separated from F. serratus, and Ascophyllum nodosum and Laminaria digitata were proved to be out-groups.

Kurzfassung

Die reichliche Ausstattung von Fucus-Arten und anderen Braunalgen mit Sekundärmetaboliten (Polyphenole und Polysaccharide) erfordert eine spezielle Isolationsmethode für DNA, die für RAPD Untersuchungen benötigt wird, da diese durch Sekundärstoffe empfindlich behindert würden. Als ausreichend gereinigt gilt ein DNA-Extrakt, wenn sich damit ein nahezu gleiches Bandenmuster erzeugen lässt wie mit seiner 10- und 100-fachen Verdünnung (McClelland & Welsh 1994). Um diese Qualität bei Braunalgen-DNA zu erreichen, wurde ein hier vorgestellter Reinigungsgang entwickelt, der u.a. auf der Entfernung von Polysacchariden mittels eines Borsäure-Harzes (,Nucleon™ PhytoPure™, plant and fungal DNA extraction' kit von Amersham™) und auf der DNA-Adsorption an Sephaglas (Sephaglas™ BandPrep kit von Amersham™) beruht. Mit seiner Hilfe war es möglich, die Arten Fucus vesiculosus, F. serratus, F. spiralis, Ascophyllum nodosum und Laminaria digitata anhand ihrer mit den Primern N 03 und N 15 (Fig. 2) generierten RAPD-Bandenmuster zu differenzieren. Die statistische Auswertung der Banden mit der Neighbour-joining-Clusteranalyse unter Verwendung des Ähnlichkeits-Indexes von Nei (1972) ergab für beide Primer dieselbe hierarchische Struktur der genetischen Diversität: Fucus spiralis und F. vesiculosus sind abgegrenzt von F. serratus. Ascophyllum nodosum stellt wie Laminaria digitata eine Außengruppe dar (Fig. 3 und 4). Das hier mittels der RAPD-Methode erzielte Ergebnis zur genetischen Diversität der drei Fucus-Arten stimmt mit Resultaten überein, die durch ITS-Sequenzierung erhalten worden sind (Leclerc et al. 1998, Serrao et al. 1999).

Keywords

seaweedfucusdna purificationrapdpolysaccharidesgenetic diversity