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Christine Lang-Hinrichs:

Extrachromosomale in-vitro-Genetik bei Pilzen

Chondriom-Vektoren bei Hefen

[Extrachromosomal in-vitro genetics in fungi. Yeast chondriom vectors.]

1986. 124 Seiten, 11 Abbildungen, 12 Tabellen, 14x22cm, 300 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 102)

ISBN 978-3-443-59003-1, brosch., price: 31.00 €

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Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

Die mitochondriale genetische Information der Sproßhefe Saccharomxces cerevisiae und der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe wurden verwendet, um Replikationssequenzen für DNA-Vektoren zu gewinnen. Die Untersuchung dieser mitochondrialen Vektoren erbrachte zusammengefaßt folgende Ergebnisse:
1. Ein in-vivo-Replikationsursprung des S.cerevisiae-Chondrioms (ori 1) wurde in ein Hybridplasmid kloniert und induzierte dessen autonome Replikation nach Transformation eines S.cerevisiae-Wirtsstammes.
2. Der Replikationsort des mitochondrialen Vektors (pScL3) ist der Kern. Hinweise für eine Einschleusung des Vektors in die Mitochondrien liegen nicht vor.
3. Das vollständige S.pombe-Chondriom wurde in Form einzelner Restriktionsfragmente in Hybridplasmiden kloniert. Zwei dieser mitochondrialen Vektoren (pPM2014 und pPM2174) zeigten autonome Replikationsfähigkeit im homologen Wirt.
4. Die Analyse der heterologen Replikationsinitiation ergab, daß der S.cerevisiae-Ursprung ori 1 in S. pombe keine autonome Replikation induziert. Dagegen besitzen verschiedene Fragmente des S. pombe-Chondrioms Replikationsaktivität in S.cerevisiae. Eine vergleichende Eingrenzung der Replikationsbereiche im homologen und heterologen Wirt zeigte, daß unterschiedliche Regionen für die Replikationsinitiation in den bei den Wirten verantwortlich sind.
Die Arbeit hat aufgezeigt, daß in zwei nicht-verwandten Ascomyceten das endogene Chondriom Basis für die Erstellung replizierender Vektoren sein kann.
Die heterologe Replikation dieser mitochondrialen Vektoren ist nicht generell möglich, doch können die S. pombe-Vektoren, die im homologen Wirt wie im heterologen Wirt S.cerevisiae autonom replizieren, Grundlage für die Entwicklung eines eukaryotischen Vektorsystems mit breiterem Wirtsspektrum sein.

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1. Einführung 1
1.1. Vektor-Wirtssysteme 3
1.2. Homologe Vektoren 5
1. 3. Heterologe Vektoren 13
1. 4. Ausblick 20
2. Problemstellung 22
3. Material und Methoden 29
3.1. Stämme 29
3.2. Plasmide 30
3.3. Reagenzien 31
3.4. Medien und Kulturbedingungen 32
3.5. DNA-Isolation aus E.coli 33
3.5.1. DNA-Schnellaufarbeitung 33
3.5.2. Plasmid-DNA-Isolation 33
3.6. DNA-Isolation aus S.cerevisiae und S.pombe 34
3.6.1. Isolation von Gesamt-DNA 34
3.6.2. Isolation von mitochondrialer DNA 34
3.7. Quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren 35
3.8. Gelelektrophorese 35
3.9. DNA-in-vitro-Rekombination 36
3.9.1 . Restriktionen 36
3.9.2. Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen 36
3.9.3. Nuklease S1-Behandlung von restfingierter DNA 36
3.9.4. Alkalische Phosphatase-Behandlung von restfingierter DNA 37
3.9.5. Ligation 37
3.10. Radioaktive DNA-Markierung und Filter-Hybridisierung 38
3.11. Transformationen 38
3.11.1. E.coli-Transformationen 38
3.11.2.Hefe-Transformationen nach der Protoplasten-Methode 40
3.11.3.Hefe-Transformationen nach der Kationen-Methode 40
3.12. Ethidiumbromid-Mutagenese 41
3.13. Messung der mitotischen Stabilität 41
3.14. Biologische SicherheitsmaBnahmen 41
4. Ergebnisse 42
4.1. Einsatz eines Replikationsursprungs des Saccharomyces
cerevisiae-Chondrioms als Basis eukaryotischer Hybridvektoren 42
4.1.1. Konstruktion des mitochondrialen Vektors 42
4.1.2. Der S.cerevisiae-mitochondriale Vektor im homologen Wirtssystem 45
a. Transformationsfrequenz 45
b. Replikationsverhalten 47
c. Mitotische Stabilität 50
d. Intrazelluläre Lokalisation 52
4.1.3. Der S.cerevisiae-mitochondriale Vektor im heterologen Wirt S.pombe 56
a. Transformationsfrequenz 56
b. Replikationsverhalten 58
c. Mitotische Stabilität 64
4.1.4. Fazit 68
4.2. Mitochondriale Genomsequenzen von Schizosaccharomyces
pombe zur Erstellung von Hybridvektoren 68
4.2.1. Klonierung von Restriktionsfragmenten der mitochondrialen
DNA und Konstruktion von Hybridvektoren 69
4.2.2. Die S.pombe-mitochondrialen Hybridvektoren im homologen
Wirtssystem 72
a. Transformationsfrequenz 72
b. Replikationsverhalten 74
c. Mitotische Stabilität 77
d. Lokalisation des Replikationsursprungs 78
4.2.3. Die S.pombe- mitochondrialen Vektoren im heterologen
Wirtssystem 79
4.2.4. Fazit 84
5. Diskussion 85
5.1. Mitochondriale Vektoren in homologen Wirtssystemen 85
5.2. Mitochondriale Vektoren in heterologen Wirtssystemen 98
6. Zusammenfassung 108
7. Literatur 110