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Johannes Müller:

Enzymatische Regulation des Fruchtkörperwachstums bei Basidiomyceten

Entwicklung eines Modells am Beispiel des Pleurotus ostreatus (Jacq. ex Fr.) Kummer

[Enzymatic regulation of fruit body development of basidiomycetes]

1986. 186 Seiten, 22 Abbildungen, 52 Tabellen, 11 Tafeln, 14x22cm, 350 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 106)

ISBN 978-3-443-59007-9, brosch., price: 41.00 €

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Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

Das Wachstum von Fruchtkörpern höherer Pilze erfordert die unpolare Einfügung neuen Zellwandmaterials. Dies setzt eine partielle Lyse der Zellwandpolysaccharide voraus. Daher wurden die Aktivitäten endogener zellwandabbauender Enzyme in Fruchtkörpern des Basidiomyceten Pleurotus ostreatus, die auf sterilisiertem Cassia—Substrat angezogen wurden, untersucht, um zu einer Modellvorstellung der enzymatischen Regulation des Fruchtkörperwachstums zu gelangen. Hierzu wurde zunächst eine Rohlösung zellwandständiger Enzyme verwendet, da ein Vergleich von Pherogrammen solcher Lösungen aus verschiedenen Fruchtkörpern und Mycelien dieses Präparat als geeignet erscheinen ließ. Die im Vergleich zum Mycel erheblich komplizierteren Proteinspektren des Fruchtkörpermaterials belegten zugleich die stärkere Differenzierung auf dieser Entwicklungsstufe. Quantitative Bestimmungen zeigten, daß thermotolerante Fruchter niedrige R-glucanolytische und chitinolytische Aktivitäten aufwiesen, während temperatursensitive Stämme hohe Aktivitäten gegen die alkaliunlösliche Zellwandfraktion erreichten. Diese Unterschiede waren weder durch verschiedene Temperatur- oder pH-Optima noch durch verschiedene Thermolabilität oder Substratspezifität verursacht.
Die Thermotoleranz beim Fruchten wird durch einen dominanten Mendelfaktor bestimmt, dessen Ft-Allel die gesamte Entwicklung von der Anlage bis zum reifen Fruchtkörper kontrolliert (Li, 1980). Damit können die Niedrigtemperatur-Fruchter als temperatursensitive Verlustmutanten angesehen werden. Es wurde daher geprüft, ob die Hochtemperatur-Fruchter einen Inhibitor für die morphogenetisch für wichtig gehaltenen zellwandlysierenden Enzyme bilden, der den Niedrigtemperatur-Fruchtern fehlte. Mischungen von Rohlösungen aus beiden Gruppen von Stämmen bestätigten die Idee eines überschüssigen negativen Effektors jedoch nicht.
Auch die spezifischen proteolytischen Aktivitäten in der Rohlösung zellwandständiger Enzyme waren verschieden. Im Gegensatz zu den Chitinasen- und R-Glucanasen-Aktivitäten waren sie jedoch in den thermotoleranten Stämmen höher. Also könnten Proteasen als Inaktivator fungieren. Die nähere Charakterisierung der Proteasen ergab für beide Gruppen von Stämmen Unterschiede hinsichtlich Temperatur- und pH-Optima sowie Thermolabilität, Substratspezifität und Inhibierbarkeit. Die Inhibierung einer Metalloprotease, deren isoelektrischer Punkt um 7,6 lag und die spezifisch war für thermotolerante Fruchter, führte zu einem Anstieg, der Zusatz der isolierten Metalloprotease zu einem Rückgang der zellwandlysierenden Enzymaktivitäten.
Aufgrund dieser Befunde wurde ein Modell zur enzymatischen Regulation des Fruchtkörperwachstums in Abhängigkeit von der Temperatur entwickelt und diskutiert: Danach können die Niedrigtemperatur-Fruchter bei Temperaturen über 20°C keine Sporophoren mehr bilden, da durch eine zu hohe Lyse-Rate die für das interkalare Zellwandwachstum notwendige Balance zwischen Synthese und Lyse gestört ist. Dagegen können die Ft-Hochtemperatur-Fruchter bis maximal 32 — 35°C fruchten, weil sie über Metalloproteasen verfügen, die die autolytischen Enzyme partiell inaktivieren können, so daß die Balance auch bei diesen höheren Temperaturen erhalten bleibt. Bei weiter ansteigenden Temperaturen (um etwa 40°C) bricht durch thermische Inaktivierung diese proteolytische Regulation zusammen.
Bei Experimenten, die die Perspektiven weitergehender Untersuchungen prüfen sollten, wurde festgestellt, daß sich der Angriff der Metalloprotease möglicherweise gegen eine endo-ß-1‚6-Glucanase (Pustulanase) mit einem isoelektrischen Punkt um 8,4 richtet. Dieses Enzym war in Zymogrammen aus Fruchtkörpern temperatursensitiver Stämme nachweisbar, nicht jedoch bei thermotoleranten Fruchtern. Der vermutete Zusammenhang zwischen der inaktivatorischen proteolytischen Regulation der Pustulanase und dem Fr-Allel wurde durch die Zymogramme eines Hybriden bestätigt. Weiter wurde gezeigt, daß die Aktivität der Metalloprotease im Unterschied zu anderen ebenfalls nachgewiesenen Protea sen mit zunehmender Wachstumstemperatur der Fruchtkörper anstieg. Ein Vergleich der Zymogramme aus Fruchtkörper- und dikaryotischem Mycelmaterial bestätigte die Annahme, daß beim Übergang vom vegetativen Stadium zum Sporophoren auf enzymatischer Ebene deutliche Veränderungen auftraten.
Abgesehen von dem in dieser Arbeit vorgestellten und diskutierten Modell einer enzymatischen Regulation des Fruchtkörperwachstums wurden auch zwei Fragen von praktischem Interesse berührt: So haben die Pherogramme verschiedener Stämme des Austernseitlings gezeigt, daß mit biochemischen Methoden ein Sortenschutz bei Pilzen möglich ist. Darüber hinaus wurden Versuche zur Anbautechnik dieses Speisepilzes auf Rückständen der Extraktion von Sennesblättern und -früchten vorgestellt und diskutiert.

Synopsis top ↑

The growth of fruit bodies in higher fungi requires non-polar insertion of new cell wall materials. This presupposes partial lysis of cell wall polysaccharides. Therefore the activities of endogenous cell wall degrading enzymes in fruit bodies of the basjdiomycete Pleurotus ostreatus - grown on a sterilized Cassia-substrate — have been investigated. Temperature tolerant strains had low R-glucanolytic and chitinolytic activities whereas temperature sensitive strains had high activities towards the alkali-resistant cell wall fraction. These differences were neither caused by different temperature- or pH-optima nor by different thermolability or substrate specificity.
As the inheritance of tolerance to high temperatures in fruiting is determined by a dominant factor, Ft, the temperature tolerant strains might produce an inhibitor which the temperature sensitive strains are lacking. Mixtures of crude solutions of both groups of strains did not support the idea of a surplus negative effector.
The specific proteolytic activities in a crude solution of wall-bound enzymes were different,too. But in contrast to the chitinolytic and glucanolytic activities they were higher in the temperature tolerant strains. Hence, proteases might act as inactivator. A detailed characterization of the proteases resulted in differences with regard to temperature- and pH-optima and thermolability, substrate specificity and the possibility of inhibition. The inhibition of a metal protease which was specifir for temperature tolerant strains caused an increase, and the addition of the isolated metal protease a decrease of the activities of cell wall degrading enzymes.
Based on these results, one can assume that the temperature sensitive strains cannot fruit at more than 20°C because of the high R-glucanolytic and chitinolytic activities, which disturb the delicate balance between synthesis and lysis of cell wall components. The thermotolerant F.-strains can fruit up to a maximum of 32 - 35°C because a metal protease partially inactivates the wall degrading enzymes. Therefore the balance is preserved even at higher temperatures, but at about 409C the proteolytic regulation collapses as the metal protease is thermically inactivated. Experiments that tested the chances of further investigations dealed with the hydrolytic activities of hybrids and vegetative dikaryons as well as with aspects of the inducibility of the proteases.
Two questions of practical importance were considered, too. Firstly, the pherograms of different strains of Pleurotus ostreatus elucidated that strain protection for mushrooms may be possible by biochemical methods. Secondly, it is reported on experiments on culture techniques for the oyster mushroom using residues of the ex traction of pods and leaves of Cassia spp. for substrate.

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I ZUSAMMENFASSUNG 9
SUMMARY 12
II EINLEITUNG 14
1 Einführung 14
2 Wissenschaftlicher Hintergrund und Problemstellung 15
3 Anwendungsbezogene Fragen 20
III MATERIAL UND METHODEN 23
1 Allgemeines 23
1.1 Stämme von Pleunotus ostreatus 23
1.2 Kulturmedien 24
1.3 Acetat-Puffer 25
1.4 Bestimmungen des pH-Wertes 25
1.5 Zentrifugen 25
2 Anbau und Lagerung von Fruchtkörpern 25
2.1 Herstellung des Impfmaterials (Pilzbrut) 25
2.2 Beimpfen und Bebrüten des Substrates 26
2.3 Produktions- und Erntephase 26
2.4 Lagerung 27
3 Mycelgewinnung und -Lagerung 27
3.1 Kulturbedingungen 27
3.2 Aufarbeitung der Flüssigkulturen 27
4 Bestimmung der Fruktifikationsfähigkeit bei verschiedenen Temperaturen 29
4.1 Entwicklungsstadien 29
4.2 Vorbereitung der Kulturen und Beimpfung der Testplatten 29
4.3 Induktion der Fruchtkörper 29
4.4 Kulturbedingungen für die Fruktifikation 30
5 Gewinnung und Reinigung von enzymhaltigen Lösungen aus Fruchtkörpern
und Mycel 31
5.1 Zeitzerstörung und Freisetzung zeitwandständiger Enzyme 31
5.2 Herstellung von Rohenzymlösungen 32
6 Bestimmung der spezifischen Aktivität zellwandständiger
Enzyme aus Fruchtkörpern 33
6.1 Proteinbestimmung 33
6.2 Bestimmung der R-Glucenasen- und Chitinasen-Aktivität 34
6.3 Glucanolytische Aktivitäten gegen verschiedene Substrate 39
6.4 Chitinolytische Aktivitäten gegen verschiedene Substrate 39
6.5 Prüfungen auf endehydrolyrische Eigenschaften
der zellwandlysierenden Enzyme 41
6.6 Bestimmung der proteolytischen Aktivität 42
6.7 Proteolytische Aktivitäten gegen verschiedene Substrate 44
7 Chromatofokussierungen 46
7.1 Versuchsaufbau und Geivorbereitung 46
7.2 Probenaufgabe und -elution 47
8 Isoelektrische Fokussierungen (IEF) 47
8.1 Isoelektrische Fokussierungen in ultradünnen Gelen 48
8.2 Isoelektrische Fokussierungen in dünnen Gelen 50
8.3 Zymogramm-Techniken 51
9 Düunschichtchromatographie von Kohlenhydraten 53
9.1 Materialien 53
9.2 Durchführung 53
IV ERGEBNISSE UND DISKUSSION 55
1 Fruchtkörperanbau 55
1.1 Brutherstellung 55
1.2 Einfluß der Anbautechnik auf die Ernte 55
1.3 Bewertung des Produktionsverlaufes 59
2 Fruktifikationstemperaturen der verwendeten Stämme 60
2.1 Ausgangsüberlegungen 60
2.2 Einstufung der einzelnen Teststämme 61
2.3 Fazit der Fruktifikationstests 61
3 Zur Zusammensetzung der alkaliunlöslichen Zellwandfraktion 64
3.1 Ausgewählte Aspekte zum Zeitwandaufbau der Basidiomyceten 64
3.2 Zur Eignung der alkaliresistenten Zellwandfraktion aus
Pleurotus ostreatus als in-vitro-Enzymsubstrat 67
3.3 Zur Verknüpfung der Glucose im R-Glucan 76
4 Herstellung einer geeigneten Rohenzymlösung 79
4.1 Modifizierte Aufarbeitungsschritte 80
4.2 Wahl einer geeigneten Proteinbestimmung 81
4.3 Untersuchungen zu Trübungen ultrafiltrierter Proben 83
4.4 Proteinspektren in Rohenzymlösungen 87
5 Prüfung eines Effektor-Modells 89
5.1 Das Effektor-ModelL 89
5.2 Autolytische Aktivitäten in ft- und Ft-Stämmen 89
5.3 Einfluß anderer Trennungsfraktionen auf die
autolyrischen Aktivitäten der Rohenzymlösung 93
5.4 Wechselseitige Beeinflussung der Rohenzymlösungen aus
ft- und Ft-Stämmen 94
5.5 Prüfung auf Inhibitoreigenschaften der Proteine mit IEP 4,3 - 4,6 95
6 Prüfung auf Unterschiede hinsichtlich Spezifität
und Optima der autolyrischen Enzyme 98
6.1 Substratspezifität 98
6.2 Temperaturabhängigkeit der autolyrischen Aktivitäten 111
7 Proteolytische Aktivitäten in Rohenzymlösungen 116
7.1 Methodisches 116
7.2 Proteolytische Aktivitäten in Rohenzymlösungen verschiedener Stämme 117
7.3 Proteolytische Aktivitäten in Abhängigkeit von der Temperatur 119
7.4 Proteolytische Aktivitäten in Abhängigkeit vom pH-Wert 119
7.5 Substratspezifität der Proteasen 123
7.6 Versuche zur Inhibition proteolytischer Aktivitäten 126
7.7 Proteolytische in-vitro-Inaktivierung der R-Glucanasen und Chitinasen 131
8 Versuche zur Auftrennung von Rohenzymlösungen 133
8.1 Proteolytische Aktivität der Proteine mit IEP
4,3 - 4,6 134
8.2 Autolytische Enzyme in verschiedenen Teileluaten
der Chromatofokussierung 135
8.3 Hydrolasen in verschiedenen Teileluaten der isoelektrischen
Fokussierung 136
9 Proteolytische Zymogramme 140
9.1 Versuche zur Auswahl einer geeigneten Zymogramm-Technik 140
9.2 Gelatine-Zymogramme aus Hoch- und Niedrigtemperatur-Fruchtern 143
9,3 Thermolabilität der Metalloprotease 144
10 Isolierung der Metalloprotease und Prüfung auf
inaktivatorische Eigenschaften 145
10.1 Isolierung und Charakterisierung der Metalloprotease 145
10.2 Zum Einfluß der Metalloprotease auf die autolytischen Enzyme 147
11 Experimente zu den Perspektiven weitergehender Untersuchungen 151
11.1 Glucan-Zymogramme 151
11.2 Hydrolytische Aktivitäten eines Hybriden 153
11.3 Einfluß der Fruktifikationstemperaturen auf
die proteolytischen Aktivitäten 154
11.4 Zymogramme von Proben aus vegetativen Dikaryen 157
V SCHLUSSDISKUSSION 158
1 Das Modell zur enzymatischen Regulation des Fruchtkörperwachstums
in Basidiomyceten im Zusammenhang 158
2 Anwendungsbezogene Fragen 164
VI LITERATUR 166
VII ANHANG 174
1 Tafeln 174
2 Lebenslauf 186