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Gabriele Leipoldt:

Zur Biologie des phytopathogenen Pilzes Gerlachia nivalis (Erreger des Schneeschimmels)

Molekularbiologische Untersuchungen an verschiedenen Feldisolaten

[On the biology of the plant pathogenic fungus Gerlachia nivalis (pathogen of snow mold): molecularbiological investigations of various field isolates.]

1987. 163 Seiten, 48 Abbildungen, 7 Tabellen, 14x22cm, 350 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 109)

ISBN 978-3-443-59010-9, brosch., price: 46.00 €

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Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

Im Rahmen dieser Arbeit zur genetischen Charakterisierung von 11 Gerlachia nivalis-Isolaten (siehe Tabelle 1) wurden Untersuchungen zum Wachstumsverhalten (Wachstumskurven, Koloniemorphologie, Resistenztests) durchgeführt. Daneben wurden Untersuchungen zur Charakterisierung der genetischen Konstitution anhand der Protein- und Esterasenbandenmuster sowie der Restriktionsanalyse der mtDNA vorgenommen. Außerdem wurden in-Vivo Experimente zum Virulenzverhalten der einzelnen Isolate gegenüber verschiedenen Wirten (Roggen- und Weizenpflanzen) durchgeführt:
1) Unterschiede in der Koloniemorphologie zwischen den einzelnen Isolaten wurden nur bei einer Kulturtemperatur von 8° C, jedoch nicht bei 21° C beobachtet: Die Roggen-Isolate bildeten Viel, die Weizen-Isolate nur wenig Luftmyzel. Zwischen den Fuberidazol-sensiblen und -resistenten Isolaten ergaben sich hinsichtlich des Wuchsbildes keinerlei Unterschiede.
2) Die Kernzahl pro Hyphenzelle war bei allen Isolaten gleich. Sie war jedoch proportional zum Zellvolumen: 1,13 Kerne pro Zelle bei einer Zellänge von 15-22 u und 2,13 Kerne pro Zelle bei einer Zellänge von 37-44 u bei gleichem Zellquerschnitt. Bei allen Isolaten wurden häufig Anastomosenbildung beobachtet.
3) Auf allen getesteten Agarmedien zeigten die einzelnen Isolate ein gleiches Wachstumsverhalten (Bestimmung des radialen Koloniezuwachses pro Tag). Dasselbe galt auch für die Fuberidazol-resistenten Isolate bei Kultur auf Agarmedien mit und ohne 20 ppm Fuberidazol.
Auch in Flüssigmedium unterschieden sich die einzelnen Isolate nicht im Wachstumsverhalten (Trockengewichtsbestimmung, Massenzunahme an Myzel pro Tag).
Dagegen zeigten sich Unterschiede in der pH-Wert-Änderung des Flüssigmediums während der Kultur zwischen den Roggen- und Weizen-Isolaten: Die Roggen-Isolate erniedrigten den pH-Wert stärker als die Weizen-Isolate (von pH 6,8 auf 0 pH 4,25 bzw. 6 pH 4,9).
4) Die Untersuchungen zur genetischen Konstitution anhand des Vergleichs der Protein- und Esterasenbandenmuster der 11 Gerlachia nivalis-Isolate ergaben:
a) Das Bandenmuster der Proteine und multiplen Esteraseformen variierte stark mit dem physiologischen Zustand des Myzels.
b) Alle Isolate wiesen unterschiedliche Bandenmuster auf. Sie müssen deshalb als genetisch verschieden betrachtet werden.
c) Zwischen den Roggen- und Weizen-Isolaten konnten spezifische Unterschiede gefunden werden, da innerhalb der einzelnen Isolat-Gruppen gemeinsame homologe Banden auftraten.
d) Außerdem wurden einzelne gemeinsame Banden bei allen 11 untersuchten Gerlachia nivalis-Isolaten beobachtet. e) Unterschiede zwischen den Fuberidazol-sensiblen und -resistenten Isolaten waren nicht festzustellen.
5) Die Untersuchungen zur Charakterisierung der Nucleinsäuren der verschiedenen Gerlachia nivalis-Isolate ergaben: a) Der Anteil an mtDNA an der Gesamtmenge der isolierten DNA betrug bei den Roggen-Isolaten 22%, bei den Weizen-Isolaten 17%. Zwischen den Fuberidazol-sensiblen und -resistenten Stämmen traten keine Unterschiede auf. Aus jungen Kulturen (3—4 d, späte logarithmische Phase) konnte doppelt so Viel mtDNA isoliert werden als aus alten (7 d, Autolyse-Stadium). Bei Zusatz von Fuberidazol (Fungizid) im Medium wurde bei den resistenten Stämmen nur noch 1/ 4 der mtDNA Menge isoliert bei unverändertem Myzelwachstum (Frischgewicht).
b) Bezüglich der Dichte von n- und mtDNA ergaben sich zwischen den einzelnen Isolaten keine Unterschiede in Bisbenzimide-Gradienten: nDNA-Dichte o = 1,705 g/cm3, mtDNA-Dichte o = 1,685 g/cm3. Im analytischen Ultrazentrifugationslauf ergaben sich für Isolat Nr. 1 und 8 folgende Dichte- und GC-Werte:
nDNA: o = 1,712 g/cm3, GC-Gehalt 53,1%
mtDNA: o = 1,688 g/cm3, GC-Gehalt 28,5%
c) Die Molekülgröße der mtDNA (ermittelt durch Restriktionsanalyse) beträgt bei den Roggen-Isolaten 58,4 i 0,34 Kb (38,55 i 0,22 Md) und bei den Weizen-Isolaten 66,9 i 0,74 Kb (44,15 i 0,49 Md).
d) Ein Vergleich der Restriktionsbandenmuster aller Isolate zeigte cha- rakteristische Unterschiede zwischen den Roggen- und Weizen-Stämmen, d. h. es traten einige für die einzelnen Stämme der jeweiligen Isolat-Gruppe gemeinsame Banden bzw. Fragmente auf.
e) Für alle 11 Isolate konnten einzelne gemeinsame Banden (Fragmente) beobachtet werden.
f) Unterschiede zwischen den Fuberidazol-sensiblen und -resistenten Isolaten bezüglich der Restriktionsmuster konnten nicht gefunden werden. g) Ferner zeigten sich keinerlei Unterschiede im Restriktionsmuster zwischen der mtDNA aus jungen (3—4 d) und alten (7 d) Kulturen. 6) In-vivo Versuche zum Virulenzverhalten der einzelnen Gerlachia nivalis-Isolate ergaben:
a) Aus stark mit Pilzen verseuchtem Saatgut konnten mit der Heißwasserbeizung (Vorquellen in H20 bidest: 5 h bei R.t, Erhöhung auf 50° C innerhalb von 40 min, Inkubationen bei 50° C, 20 min, Trocknen bei R.t.) befallsfreie Getreidekörner und -pflanzen für die Infektionsversuche hergestellt werden.
b) Homologe Infektionsversuche (Roggenpflanzen in mit Roggen-Isolaten verseuchter Erde, Weizenpflanzen in mit Weizen-Isolaten verseuchter Erde) und heterologe Infektionsversuche (Roggenpflanzen in mit Weizen-Isolaten verseuchter Erde, Weizenpflanzen in mit Roggen-Isolaten verseuchter Erde) ergaben, daß bei den untersuchten Gerlachia nivalis Stämmen eine Anpassung (Wirtsspezifität) an den jeweiligen Wirt, von dem sie isoliert worden waren, vorhanden ist: Bei homologen Infektionen konnte eine 100%ige Befallsrate beobachtet werden, bei heterologen Infektionen im Durchschnitt nur 18% (cytologische Auswertung). Im heterologen System konnte nur auf den Coleoptilen Myzel nachgewiesen werden, im homologen System dagegen auch auf den Blättern.
7) Aus den unter 1-6 aufgeführten Ergebnissen kann geschlossen werden, daß bei den untersuchten Gerlachia nivalis-Isolaten eine Wirtsspezifität vorhanden ist. Diese Wirtsspezifität ist sowohl anhand von phänotypischen als auch von genotypischen Merkmalen nachweisbar.

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1. EINLEITUNG 1
2. MATERIAL UND METHODEN 5
2.1 Chemikalien und Sterilisationsverfahren 5
2.1.1 Chemikalien 5
2.1.2 Sterilisation von Geräten 6
2.1.3 Sterilisation von Lösungen und Nährmedien 6
2.1.4 Sterilisation von Dialyseschläuchen 6
2.2 Art und Herkunft der untersuchten Pilz-Isolate 6
2.3 Anzucht der Pilz-Isolate 8
2.3.1 Kultur auf Agarplatten 8
2.3.2 Kultur in Flüssigmedium 10
2.4 Morphologische Charakterisierung der Pilz-Isolate 10
2.4.1 Ausbildung von Konidien und Perithecien 10
2.4.2 Kolaniemorphologie auf Agarplatten bei verschiedenen
Kulturtemperaturen 11
2.4.3 Kernzahlbestimmung pro Zelle und Anastomosenbildung 11
2.5 Wachstumsverhalten der Pilz-Isolate 12
2.5.1 Wachstumskurven in Flüssigmedium 12
2.5.2 pH-Wert-Änderung des Mediums während der Kulturdauer 13
2.5.3 Wachstumskurven auf Agarplatten 13
2.5.4 Wachstumskurven auf Agarplatten unter Zusatz
von Fungizid (Resistenz-Test) 13
2.6 Genetische Charakterisierung der Pilz-Isolate anhand von Proteinen 14
2.6.1 Isolierung saurer löslicher Proteine 14
2.6.2 Herstellung von Polyacrylamid-Porositätsgradientengelen . 15
2.6.3 Elektrophoretische Trennung der Proteine 15
2.6.4 Nachweis der Proteine im Gel 16
2.6.5 Nachweis von Esterasen im Gel 16
2.6.6 Photographie der Gele 16
2.7 Isolierung von Nucleinsäuren 16
2.7.1 Isolierung der Gesamtnucleinsäuren 16
2.7.2 Isolierung extrachromosomaler Nucleinsäuren 19
2.7.3 Isolierung mitochondrialer DNA 23
2.7.4 Bestimmung der DNA-Konzentration in Lösungen 26
2.8 Reinigung der Nucleinsäuren 26
2.8.1 HAP-Säulenchromatographie 26
2.8.2 Sephacryl-S-1000-Säulenchromatographie 28
2.8.3 Dichtegradienten-Zentrifugation : . 29
2.9 Charakterisierung der Nucleinsäuren 31
2.9.1 Agarose-Gelelektrophorese 31
2.9.2 Polyacrylamid-Porositätsgradienten-Gelelektrophorese 32
2.9.3 Photographie der Gele 33
2.9.4 Dichtegradienten-Zentrifugation: Bestimmung der Dichte
sowie des GC-Gehaltes der DNA-Fraktionen 33
2.9.5 Photographie der Gradienten 33
2.9.6 RNasen-Behandlung 33
2.9.7 DNasen-Behandlung 34
2.9.8 Zymolyase-Behandlung 34
2.10 Charakterisierung der mitochondrialen DNA 35
2.10.1 Bestimmung der Dichte und des GC-Gehaltes 35
2.10.2 Bestimmung der Molekülgröße mit Hilfe von Restriktionsendonucleasen 35
2.10.3 Vergleichende Restriktionsanalyse 37
2.11 in-vivo-Experimente zum Virulenzverhalten der Pilz-Isolate 37
2.11.1 Herkunft und Art des verwendeten Saatguts 37
2.11.2 Herstellung von pilzfreien Getreidekeimlingen 38
2.11.3 Anzucht der Pilz-Isolate und Inokulation von Erde 38
2.11.4 Durchführung des Infektionsversuches 40
2.11.5 Bonitur von Symptomausbildungen 40
2.11.6 Cytologische Untersuchung des Pflanzenmaterials 40
3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 43
3.1 Morphologische Charakterisierung der Pilzspeeies 43
3.1.1 Konidien- und Perithecienbildung 43
3.1.2 Koloniemorphologie bei verschiedenen Temperaturen 46
3.1.3 Kernzahlbestimmung pro Zelle und Anastomosenbildung 47
3.2 Wachstumsverhalten der Pilz-Isolate 49
3.2.1 Wachstumsverhalten in Flüssigmedium 49
3.2.2 ph-Wert-Änderung des Mediums während der Kulturdauer 51
3.2.3 Wachstumsverhalten auf Agarplatten 54
3.2.4 Resistenz-Test 57
3.3 Genetische Charakterisierung der Pilzspecies anhand von Proteinen 60
3.3.1 Bandenmuster saurer löslicher Proteine
in Polyacrylamidporositätsgradienten-Gelen 65
3.3.2 Bandenmuster der Esterasen in
Polyacrylamidporositätsgradienten-Gelen 66
3.4 Vergleich der verwendeten Prozeduren zur Nucleinsäuren-Isolierung 67
3.4.1 ClAB-Methode zur Isolierung von n und mtDNA 67
3.4.2 Methode zur Isolierung von extrachromosomaler DNA 68
3.4.3 mtDNA-Isolierung aus isolierten Mitochondrien 70
3.5 Vergleich der verwendeten Methoden zur Reinigungder Nucleinsäuren 72
3.5.1 HAP-Säulenchromatographie 72
3.5.2 Sephacryl-S-1000 Superfine Säulenchromatographie 74
3.5.3 Dichtegradienten-Zentrifugation 74
3.6 Charakterisierung der Nucleinsäuren 77
3.6.1 Vergleich Agarose- und
Polyacrylamidporosisitätsgradienten-Gelelektrophorese 77
3.6.2 Auftreten von distinkten RNA-Banden in der Elektrophorese 78
3.6.3 Bestimmung der Dichte sowie des GC-Gehaltes der
Nucleinsäuren durch Dichtegradienten-Zentrifugation 79
3.7 Charakterisierung der mitochondrialen DNA 80
3.7.1 Dichtebestimmung und GC-Gehalt 80
3.7.2 Molekülgrößenbestimmung 81
3.7.3 Vergleichende Restriktionsanalyse der Gerlachia nivalis-Isolate 85
3.8 in-vivo-Experimente zum Virulenzverhalten der Pilz-Species 88
3.8.1 Herstellung von pilzfreien Getreidekeimlingen 88
3.8.2 Symptomausprägung während des Infektionsversuchs 89
3.8.3 Cytologische Untersuchung des infizierten Pflanzenmaterials 96
3.8.4 Vergleich der Versuchsauswertung anhand von
makroskopischer Bonitur und mikroskopischer (zytologischer) Auswertung 102
4. DISKUSSION 103
4.1 Morphologische Charakterisierung der Pilzspeeies 103
4.1.1 Unterscheidungsmöglichkeit der einzelnen Gerlachia
nivolis-Isolate anhand ihrer Kolaniemorphologie 103
4.1.2 Bestimmung der Kernzahl pro Hyphenzelle 103
4.2 Vergleich des Wachstumsverhaltens der Gerlachia nivolis-Isolate
in Flüssigmedium und auf Agarplatten 105
4.3 Phänatypische Charakterisierung der Gerlachianivolis-Isolate
anhand von Protein- und Esterasenbandenmuster 106
4.4 Genetische Charakterisierung der Gerlachia nivolis-Isolate
anhand von Untersuchungen verschiedener
Nucleinsäuren-Species 107
4.4.1 Charakterisierung der "extra"-RNA und mögliche
Deutung ihrer Herkunft 108
4.4.2 Restriktionsanalyse der mtDNA 109
4.4.2.1 Bestimmung der Molekülgröße der mtDNA 109
4.4.2.2 Vergleich der mtDNA-Restriktionsbandenmuster
der verschiedenen Gerlachia nivalis-Isolate 110
4.4.2.3 Vergleich der Ergebnisse zu den Untersuchungen
der Protein- sowie Esterasenbandenmuster und zu
denen der mtDNA-Restriktionsanalysen (Restriktionsbandenmuster) 111
4.5 in-vivo-Experimente zum Virulenzverhalten der Pilzspeeies 112
4.5.1 Möglichkeit einer schonenden Beizung von Saatgut 112
4.5.2 Unterschiedliches Virulenz-Verhalten der Weizen- und
Roggen-Isolate auf Roggen und Weizenpflanzen 113
4.6 Anwendungsmöglichkeiten 114
4.6.1 Herstellung von pilzfreiem Saatgut durch Heißwasserbeizung 114
4.6.2 Möglichkeiten der Taxonomischen Einordnung einzelner
Arten, formae speziales sowie Rassen anhand von
Untersuchungen der mtDNA und der Proteine (Enzyme) 115
5. ZUSAMMENFASSUNG 116
6. LITERATUR 119
Danksagung 128
Anhang: Abbildungen 129