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Erika Schulte:

Einfluß struktureller Umordnungen des Chondrioms auf die Seneszenz bei Podospora anserina

[Effect of mitochondrial DNA rearrangements on the senescence with Podospora anserina]

1988. 103 Seiten, 17 Abbildungen, 10 Tabellen, 14x22cm, 250 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 122)

ISBN 978-3-443-59023-9, brosch., price: 31.00 €

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Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

Die vorliegende Arbeit stellt die Untersuchung der beiden langlebigen Mutanten exl und ex2 von Podosgora anserina vor. Exl und ex2 zeigen im Vergleich zum Wildtyp extrem verlängertes Wachstum, Wachstumsrate und Fertilität sind jedoch verringert. In Myzelrohextrakten ist keine Cytochrom-c-oxidase Aktivität mehr nachweisbar. Durch Kreuzungsanalysen wurde die extrachromosomale Vererbung der Langlebigkeit bei exl und ex2 gezeigt. Die mitochondriale DNA dieser Mutanten wurde daher mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden näher charakterisiert. Zusammengefaßt lieferten die Experimente folgende Ergebnisse:
l. Das Gen für die Untereinheit I der Cytochrom-c-oxidase (COI) ist fast vollständig deletiert. Das erste Intron dieses Gens, die plDNA, ist in den beiden langlebigen Mutanten nicht mehr nachweisbar. Dieser Befund ist ein weiteres Indiz für die zentrale Rolle der plDNA während der Seneszenz.
2. Rekombinationen an kurzen direkt wiederholten Sequenzen haben zu einer mehrteiligen Organisation der mtDNA geführt. Diese Genomorganisation ist über einen langen Zeitraum stabil erhalten geblieben.
3. Als Folge dieser Rekombinationen sind neue Anordnungen mitochondrialer Gene entstanden: z. B. ist in das stark verstümmelte COI-Gen die Region des ATPase8-Gens und der 5' Bereich des Gens für die Untereinheit I der NADH- Dehydrogenase integriert. 4. Neu kombinierte Gene führen zur Bildung neuer Transkripte, während von den Rekombinationen nicht betroffene Gene (z. B. LrRNA-Gen, SrRNA-Gen) korrekt transkribiert werden.
Abschließend läßt sich sagen, daß mit der Analyse der mtDNA der langlebigen extrachromosomalen Mutanten exl und ex2 von Podospora anserina weitere Einblicke in die Organisation mitochondrialer Genome bei Hyphenpilzen gewonnen werden konnten. Darüberhinaus wurde ein Beitrag zum Verständnis der Vorgänge bei der Rekombination von Organellen-DNA geleistet und neue Hinweise zur Rolle der plDNA während der Seneszenz gegeben.

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I. Einführung
A. Einleitung 1
B. Rekombinationsvorgänge der Plastiden-DNA 4
1. Intermolekulare Rekombination 5
2. Intramolekulare Umordnungen der Chloroplasten-DNA 6
a) "flip-flop" Rekombination 6
b) Strukturelle Umordnungen durch nicht-homologe Rekombination 6
C. Rekombinationsvorgänge der mitochondrialen DNA 8
1. Strukturelle Umordnung des Chondrioms der höheren Pflanzen 9
a) Intermolekulare Rekombination 9
b) Intramolekulare Rekombination 10
i) Mehrteilige Struktur der mtDNA durch homologe Rekombination 10
ii) homologe Rekombination und CMS in Mais 12
ii) Nicht-homologe Rekombination in Oenothera 14
2. Strukturelle Umordnungen des Chondrioms bei Ascomyceten 15
a) Rekombinationen der mtDNA von Saccharomyces cerevisiae 15
b) Strukturelle Umordnungen der mtDNA von Hyphenpilzen 17
D. Transposition von Organellen-DNA 20
E. Zusammenfassung 21
II. Problemstellung 23
II. Material und Methoden 25
A. Material 25
1. Stämme 25
2. Plasmide 25
3. Chemikalien 26
4. Puffer 26
5. Medien 26
B. Methoden 27
1. Kulturbedingungen 27
a) Podospora anserina 27
b) E. coli 27
2. Kreuzungsanalyse 27
3. Bestimmung der Cytochrom-c-oxidase Aktivität 27
4. DNA-Präparation 27
5. Restriktion und Gelelektrophorese 28
6. "Southern Blots" und DNA-DNA Hybridisierungen 28
7. RNA-Präparation und "Northern" Analysen 28
8. Klonierung von in vitro Bekombinierter DNA 28
a) pNEO 28
b) EMBL3 29
c) M13mpl9 29
9. DNA-Sequenzierung 29
10. Sicherheitsmaßnahmen 29
IV. Ergebnisse 30
A. Isolierung von langlebigen Mutanten von Podospora anserina 30
B. Kreuzungsanalysen 31
C. Bestimmung der Cytochrom-c-oxidase Aktivität 32
D. Charakterisierung des mitochondrialen Genoms der
langlebigen Mutanten ex1 und ex2 36
1. Nachweis von plDNA-Sequenzen 36
2. Kartierung der mtDNA von ex1 und ex2 38
3. Analyse von Hybridfragmenten der ex1 mtDNA 42
a) Lokalisation 42
b) Klonierung 45
c) Restriktionskarten 46
4. Sequenzierung der Rekombinationestellen in dem Hybridfragment EB1 49
5. Analyse der Genomstruktur der ex1mtDNA 53
a) Konstruktion einer ex1 mtDNA-Bank in dem Vektor EMBL3 53
b) Überprüfung der Qualität der Genbank 55
c) Identifizierung einzelner Subzirkel 57
6. Stabilität des mehrteiligen mitochondrialen Genoms in ex1 61
E. Transkriptanalysen 64
V. Diskussion 67
A. Mehrteilige mitochondriale DNA in langlebigen
Mutanten von Podospora anserina 67
1. Organisation der mtDNA 67
2. Struktur von Rekombinationsstellen 72
3. Expression von rekombinierten Genbereichen 78
B. Alternative Energiegewinnung in obligat aeroben Organismen 81
C. Die Rolle der plDNA in der Seneszenz 84
VI. Zusammenfassung 89
VII. Literaturverzeichnis 91