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Andrea Düvell:

Struktur und Funktion linearer Plasmide bei dem phytopathogenen Ascomyceten Claviceps purpurea

1989. 82 Seiten, 24 Abbildungen, 4 Tabellen, 14x22cm, 240 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 126)

ISBN 978-3-443-59027-7, brosch., price: 36.00 €

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Contents

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I. EINLEITUNG 1
1. Allgemeine Grundlagen der Pathogenese 1
2. Biochemische Aspekte der Wirt-Parasit-Beziehung 3
2.1. Resistenzfektoren 3
2.2. Virulenzfaktoren 7
2.3. Avirulenzfaktoren 10
3. Die Anwendung molekulargenetischer Techniken bei der Aufklärung der
genetischen Grundlagen und spezifischer Mechanismen der Pathogenese 11
3.1. Transformationasysteme bei photopathogenen Pilzen 12
3.2. Transformation bei höheren Pflanzen 17
3.3. Klonierung von Virulenz- und Resistenzgenen 19
3.4. Die Rolle extrachromosomaler DNA bei der Pathogenese 23
II. PROBLEMSTELLUNG 27
III. MATERIAL UND METHODEN 30
1. Stämme 30
2. Nährmedien und Kulturbedingungen 30
3. Plasmide 30
4. Chemikalien und Materialien 32
5. Häufig verwendete Puffer 32
6. DNA-Isolation 33
6.1. DNA-Isolation aus Claviceps purpurem 33
6.1.1. Isolation mitochondrialer DNA mit geringer Plasmidkonzentration 33
6.1.2. Isolation mitochondrialer DNA mit hohen Plasmidkonzentrationen 33
6.2. Plasmidisolation aus Escherichia coli 33
6.3. DNA-Elution aus Agarosegelen 34
7. Restriktionsanalyse 34
8. Exonukleaseverdauungen 34
9. DNA/DNA-Hybridisierungen 34
9.1. "Nick"-Translation 34
9.2. "Random-Prime-Labeling" 34
9.3. "Southern-Blotting" 34
9.4. "Southern"-Hybridisierung 35
9.5. Koloniefilterhybridisierung 35
10. Endmarkierungen 36
10.1. 5'-Endmarkierung mit T4-Polynukleotidkinase 36
10.2. 3'-Endmarkierung mit terminaler Transferase 36
10.3. 3'-Endmarkierung mit Klenow-Polymerase 36
11. DNA-Ligation und E. coli-Transformation 36
12. Elektronenmikroskopie 37
13. Transkriptanalyse 37
13.1. Isolation mitochondrialer mRNA aus Claviceps purpuren 37
13.2. RNA-Gelelektrophorese 38
13.3. "Northern"-Blotting und Hybridisierung 38
13.4. Nuklease S1-"Mapping" 38
14. Sicherheitsmaßnahmen 38
IV. ERGEBNISSE 39
1. Restriktionsanalyse 39
2. Struktur der Enden der Plasmide 41
2.1. Nachweis terminal invers repetitiver Sequenzen 42
2.2. Hinweise auf die Assoziation der Plasmide mit Proteinen 43
2.2.1. Auftreten der K-Plasmide nach Proteinase-K-Behandlung 43
2.2.2. Exonuklease-Verdauung der Plasmide 44
2.2.3. Markierbarkeit der 3'75'-Enden 45
3. Klonierung der linearen Plasmide des Stammes K 47
3.1. Die zentralen EcoRI-Fragmente 47
3.2. Die Endfragmente 48
3.2.1. Das "rechte" Ende von pClK1 (EcoRI-2) 49
3.2.2. Das "linke" Ende von pClK1 (EcoRI-4) 51
3.3. Die HaeIII-Fragmente 53
3.4. Feinanalyse der Endklone 54
3.5. Zusammenfassung aller Klonierungsexperimente 55
4. Homologie-Untersuchungen 57
4.1. Hybridisierung von pClK1 mit linearen Plasmiden anderer
Organismen 57
4.1.1. Eingrenzung des homologen Bereiches zum Brassica 11,3kb
Plasmid 59
4.1.2. Die Homologie zwischen pClK1 und dem Sl-Plasmid von Zea mays 60
4.1.3. Die kalDNA von Neurospora intermedia: Nachweis von zwei
homologen Bereichen auf pC1K1 61
4.2. Hybridisierung der K-Plasmide mit mitochondrialen Genen 61
5. Funktion 62
5.1. Transkriptanalyse 63
5.2. Nuklease S1-"Mapping" 65
V. DISKUSSION 70
1. Die Struktur der K-Plasmide 70
2. Die Klonierung der linearen Plasmide von Claviceps purpurea 75
3. Analyse einer möglichen Funktion der K-Plasmide 76
3.1. Die K-Plasmide und die Pathogenität von Claviceps purpurea 79
4. Homologien der K-Plasmide zu anderen linearen Plasmiden 79
VI. ZUSAMMENFASSUNG 85
VII. LITERATURVERZEICHNIS 86
VIII. ANHANG 108
Vorveröffentlichungen 108