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Jörg Kämper:

Extrachromosomale DNA-Elemente als Grundlage für die Entwicklung von Vektorsystemen bei Hefen

Konstruktion linearer Vektoren auf der Basis der linearen DNA-Killerplasmide der Hefe Kluyveromyces lactis

[Development of vector systems in yeast based on extrachromosomal DNA elements. Constructing linear vectors on the basis of linear DNA killer plasmids of the yeast Kluyveromyces lactis]

1990. X, 114 Seiten, 29 Abbildungen, 14x22cm, 270 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 136)

ISBN 978-3-443-59037-6, brosch., price: 36.00 €

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Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

In der vorliegenden Arbeit wird die Herstellung und Charakterisierung von linearen Hybridplasmiden auf der Basis der linearen Killerplasmide aus Kluyveromyces lactis vorgestellt. Zusammengefaßt liefern die Untersuchungen folgende Ergebnisse:
1. Das lineare Plasmid pGKLl kann durch In vivo-Rekombinationsprozesse verändert werden. Transformierte Fremd-DNA wird in das Plasmid gezielt integriert oder gegen Plasmidbereiche ausgetauscht.
2. Die Insertion eines Kern-Gens, des LEU2-Gens aus Saccharomyces cerevisiae, in das Plasmid pGKLl führt zu linearen Hybridplasmiden, die anstelle der terminalen Proteine des nativen Plasmids typische Hefe-Telomerstrukturen an den Enden besitzen. Das LEU2-Gen kann auf dem zytoplasmatisch lokalisierten Plasmid nicht exprimiert werden; erst das Anheften von Telomeren und die daraus resultierende nukleäre Lokalisation erlaubt eine Expression des Gens.
3. Die Insertion des LEU2-Gens, versehen mit den Promotor- und Terminator-Bereichen des Killertoxin-Gens von pGKLl, führt zu einem linearen Hybridplasmid (pJKLl), das alle Struktur-Elemente und Eigenschaften der nativen linearen Plasmide besitzt. Die 5'-Enden der terminalen, invers repetitiven DNA-Sequenzen von pJKLl sind durch Proteine blockiert, das Plasmid ist im Zytoplasma lokalisiert und besitzt eine mit pGKLl vergleichbare hohe Stabilität und Kopiezahl.
4. Das LEU2-Gen von pJKLl wird von dem für die Fusion verwendeten Killertoxin-Promotor aus transkribiert. Auf von pGKLl abgeleiteten Hybridplasmiden werden weder der Promotor noch der Terminator des Kern-LEU2-Gens erkannt. Die Ergebnisse sind ein Beweis für ein eigenständiges Transkriptionssystem der Killerplasmide.
5. Das Plasmid pJKLl kann als Protein-DNA-Komplex in Saccharomyces cerevisiae transformiert werden.
Mit der Konstruktion des Plasmids pJKLi ist es erstmalig gelungen, Fremd-DNA in ein lineares Plasmid einzufügen und gleichzeitig dessen native Struktur zu erhalten. Wegen ihrer hohen Kopiezahl, der hohen Stabilität und wegen ihres eigenständigen Transkriptions-Systems stellen diese linearen Hybridplasmide generell eine Alternative zu den zirkulären Hefevektoren dar.
Die Vorgehensweise, lineare Plasmide gezielt zu verändern, eröffnet zudem Möglichkeiten, die Plasmide bezüglich ihrer Gen-Funktion und Regulation zu charakterisieren.

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Extrachromosomale DNA-Elemente als Grundlage fur die
Entwicklung von Vektorsystemen bei Hefen
Inhaltsverzeichnis
A. Extrachromosomale DNA-Elemente als Grundlage für die Entwicklung
von Vektoren bei Hefen
I. Einführung l
II. Die 2 My m DNA von Saccharomyces cerevisise 4
1. Struktur und Organisation 4
2. Lokalisation und Replikation 6
3. Verteilungsmechanismus 7
4. Anwendung des Verteilungsmechanismus 8
5. Amplifikationsmechanismus 9
a. Erhöhung der Kopiezahl durch Rekombination 9
b. Regulation 11
6. Auswirkungen des Ampllfikationssystems auf Blum Vektoren 13
a. Instabilität durch Rekombination 13
b. Stabilisierung durch Amplifikation 14
c. Vektoren frei von bakteriellen Bereichen 15
III. Blum DNA-verwandte Plasmide 15
IV. Blum Plasmide 16
V. Killerplasmide bei Kluyveromyces lacLis 17
1. Allgemeine Eigenschaften 17
2. Überführung der Plasmide in andere Hefen 18
3. Struktur und Organisation 18
4. Replikation 21
5. Killertoxin 22
a. Struktur und Wirkung 22
b. Expression 23
6. Mutationen
7. Verwendung als Vektorsystem 25
VI. Lineare Plasmide in anderen Hefen 26
VII. Anwendung von Hefe-Transformationssystemen 27
B. Konstruktion linearer Vektoren auf der Basis der linearen
DNA-Killerplasmide aus Kluyveromyces lactis
Einführung und Problemstellung 30
C. Material und Methoden 33
I. Material 33
II. Methoden 35
D. Ergebnisse 40
1. Konstruktion von linearen Plasmiden durch in vivo Rekombination 40
2. Entmischung von Plasmiden 41
a. Subkultivierung von TL157 41
b. Transformation mit pLS1 und pLB1 42
3. Restriktionskartierung von pLS1 und pLB1 43
4. Ableitung von pLS1 aus pLB1 47
5. Charakterisierung der Endfragmente 47
a. Untersuchung auf terminale Proteine 47
b. Restriktionsfeinkartierung 48
c. Nachweis Telomer-spezifischer Sequenzen 49
d. Sequenzanalyse der Endfragmente 49
6. Lokalisierung von pLS1 und pLB1 51
7. Konstruktion eines Vektors zur in vivo-Rekombination
mit einem zytoplasmatischen LEU2-Gen 53
a. Vorbereitung des Promotor-Bereichs 53
b. Fusion des Promotors mit dem LEU2-Gen 55
c. Einfügen eines Terminatorbereichs 56
8. Transformation mit dem zytoplasmatischen LEU2-Fragment 58
9. Physikalische Charakterisierung der linearen Hybridplasmide 59
10. Stabilitätsuntersuchungen 63
11. Lokalisierung von pJKL1 66
12. Transkriptanalyse des zytoplasmatischen LEU2-Gens 67
a. Transkriptnachweis 68
b. Kartierung des Transkriptstartpunktes 69
13. Transformation mit pJKL1 71
E. Diskussion 74
1. Rekombination von linearen Plasmiden mit Fremd-DNA 74
2. Replikation der Plasmide pLS1 und pLB1 75
3. Lokalisierung der Telomerplasmide pLS1 und pLB1 77
4. Anheften von Telomerstrukturen 78
5. Bildung von Telomerplasmiden 83
6. Inkompatibilität von pLB1 und pLS1 mit pGKL1 und pGKL2 84
7. In vivo-Rekombination mit dem zytoplasmatischen LEU2-Gen 84
8. Transkript-Untersuchungen 89
a. Initiation der Transkription 89
b. Termination go
c. Promotor-Aktivität 91
9. Transformation 92
10. Stabilität 93
11. Eignung als Vektorsystem 94
F. Zusammenfassung 96
G. Literatur 98
Anhang: Vorveröffentlichungen