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Matthias Rohe:

Untersuchungen zur Phylogenese linearer genetischer Elemente

Extrachromosomale DNA des Ascomyceten Morchella conica

1992. 118 Seiten, 25 Abbildungen, 14x22cm, 260 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 146)

ISBN 978-3-443-59047-5, brosch., price: 31.00 €

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Contents

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1. Einleitung 1
1.1. Vorkommen und Struktur linearer Plasmide 1
1.2. Mögliche verwandschaftliehe Beziehungen:
Strukturell ähnliche Elemente 7
1.2.1. Adenoviren 8
1.2.2. Prokaryotische Viren 10
1.3. Replikationsmechanismus der linearen Plasmide 11
1.4. Cytoplasmatische lineare Plasmide 13
1.4.1. Eigenschaften und Struktur 13
1.4.2. Anwendungsbezogene Aspekte der cytoplasmatischen
linearen Plasmide 14
1.5. Mitochondriale lineare Plasmide 16
2. Problemstellung 19
3. Material und Methoden 23
3.1. Material 23
3.1.1. Chemikalien 23
3.1.2. Geräte 23
3.1.3. Stämme und Plasmide 23
3.1.4. Oligonukleotide 24
3.1.5. Nährmedien, Puffer und Lösungen 24
3.1.5.1. Nährmedien 24
3.1.5.2. Puffer und Lösungen 25
3.1.6. Computersoftware und Datenbanken 28
3.2. Methoden 30
3.2.1. Kulturbedingungen 30
3.2.1.1. Anzucht von Morchella conica 30
3.2.1.2. Anzucht von E.coli 30
3.2.2. Nukleinsäure-Isolierung 30
3.2.2.1. Isolierung der Gesamt-DNA aus Morchella conica 30
3.2.2.2. Isolierung der linearen Plasmide von Morchella conica 31
3.2.2.3. Isolierung von mtDNA aus Morchella conica 31
3.2.2.4. Plasmid-Minipräparation aus E.coli 31
3.2.2.5. Plasmid-Maxipräparation aus E.coli 32
3.2.2.6. Isolierung von ssDNA des Phagen M13 32
3.2.2.7. Isolierung von dsDNA des Phagen M13 33
3.2.3. Reinigung und Konzentration von DNA-Proben 33
3.2.3.1. Phenol- und Chloroformextraktion von DNA-Proben 33
3.2.3.2. Dialyse von DNA-Proben 34
3.2.3.2.1. Dialyse im Dialyseschlauch 34
3.2.3.2.2. Filterblatt- Dialyse 34
3.2.3.3. Alkohol-Fällung von DNA-Proben 34
3.2.3.4. Gelfiltration mit Sephadex 35
3.2.3.5. Ionenaustauschchromatographie mit DEAE 52-Cellulose 35
3.2.4. Methoden zur in vitro Rekombination von DNA 36
3.2.4.1. Restriktion von DNA 36
3.2.4.2. Dephosphorylierung der 5'-Enden von DNA 36
3.2.4.3. Ligation von DNA-Fragmenten mit T4-Ligase 36
3.2.4.4. Klonieren mit low-melting Agarose 36
3.2.4.5. Transformation von E. coli 37
3.2.4.6. Transfektion mit M13-Phagen 37
3.2.5. Elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren.38
3.2.5.1. DNA-Agarosegelelektrophorese 38
3.2.5.2. Elektroelution von DNA-Fragmenten 38
3.2.5.3. Elektrophoretische Auftrennung von RNA 38
3.2.5.4. Polyacrylamidgele 39
3.2.6. Oligonukleotidsynthese 39
3.2.6.1. Synthese der Oligonukleotide 39
3.2.6.2. Reinigung der OligonuRleotide 40
3.2.7. Hybridisierungstechniken 40
3.2.7.1. DNA-Transfer auf Nylonmembranen 40
3.2.7.2. RNA-Transfer auf Nylonmembranen 40
3.2.7.3. Markierung der DNA-Sonden 40
3.2.7.4. DNA-DNA-Hybridisierung 41
3.2.7.5. RNA-DNA-Hybridisierung 41
3.2.7.6. Immunologischer Nachweis der Hybridisierungssignale 42
3.2.8. DNA-Sequenzierung 43
3.2.8.1. Sequenzierungsreaktion 43
3.2.8.2. Auftrennung der Sequenzierungsreaktionen auf Polyacrylamidgelen 44
3.2.8.3. Herstellung von sequentiell verkürzten rekombinanten M13-Klonen 44
3.2.8.4. Schnellanalyse zur Klonauswahl 45
3.2.8.5. Identifizierung von rekombinanten M13-
Klonen mit invers orientierten Insertionen 45
3.2.9. Sicherheitsmaßnahmen 45
4. Ergebnisse 46
4.1 pMC3-2 und der Stamm Morchella conica 3 46
4.2 pMC3-1 und pMC3-2 48
4.3 Klonierung des BglII-4 Restriktionsfragments
aus pMC3-2 in Sequenzierungsvektoren 49
4.4 Sequenzierung des Plasmids pMC3-2 51
4.5 Analyse der invers repetitiven Enden (TIRs) 59
4.6 Analyse der Codierungskapazität 64
4.6.1. Offene Leserahmen 64
4.6.2. Homologie der ORFs von pMC3-2 zu bekannten Proteinen 64
4.6.2.1. ORF1 64
4.6.2.2. ORF2 und sonstige Codierungskapazität 68
4.7. Transkriptanalyse von pMC3-2 69
4.8. Ermittlung der Verwandschaftsverhältnisse der
linearen Elemente untereinander 70
5. Diskussion 75
5.1. Invers repetitive Enden (TIRs) von pMC3-2 75
5.2. Die ORFs von pMC3-2 75
5.2.1. ORF1 von pMC3-2 codiert für eine DNA-Polymerase 76
5.2.2. ORF2 77
5.3. Transkription von pMC3-2 78
5.4. Genetische Organisation und Codierungskapazität 79
5.5. Codongebrauch und Basensusammensetzung 80
5.6. Evolutionärer Ursprung und Verwandschaftsverhältnisse
von pMC3-2 und anderen linearen genetischen Elementen 82
6. Zusammenfassung 86
7. Literatur 88
8. Anhang 102
A. Von den Nukleotidsequenzen der ORFs abgeleitete Aminosäuresequenzen 102
B. Vergleiche der RNA-Polymerasen und Matrixtabellen, die
als Grundlage zur Berechnung des Stammbaums dienten 103
C. Vergleiche der RNA-Polymerasen und Matrixtabellen, die
als Grundlage zur Berechnung des Stammbaums dienten 114
D. Lebenslauf 119