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Markus Walz:

Molekulare Analysen zur Expression von ß-Lactam-Genen bei Acremonium chrysogenum

1992. 101 Seiten, 23 Abbildungen, 11 Tabellen, 14x22cm, 240 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 147)

ISBN 978-3-443-59048-2, brosch., price: 36.00 €

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Contents

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Molekulare Analysen zur Expression von ß-Lactam-Genen
bei Acremonium chrysogenum
I. Einführung 1
1. Einleitung 1
2. Antibiotika und ihre Produzenten 2
3. Die Biosynthese von ß-Lactam-Antibiotika 4
4. Untersuchungen zur Regulation der Antibiotika-Synthese 7
5. Die Evolution der ß-Lactam-Biosynthese 11
6. Halbsynthetische Antibiotika 13
7. Zusammenfassung und Ausblick 16
II. Problemstellung 17
III. Material und Methoden 20
1. Material 20
1.1 Organismen 20
1.1.1 Bakterien 20
1.1.2 Pilze 20
1.2 Medien 21
1.3 Plasmide 21
1.4 Chemikalien 21
1.5 Enzyme 22
1.6 Oligonukleotide 22
1.7 Häufig verwendete Puffer 22
2. Methoden 23
2.1 Kulturbedingungen 23
2.1.1 Bakterien 23
2.1.2 Pilze 23
2.2 DNA-Isolierung 23
2.3 RNA-Isolierung 23
2.4 Restriktion von DNA und DNA-Gelelektrophoresen 23
2.5 Southern-Blots und DNA-DNA-Hybridisierungen 23
2.6 Northern-Blots und RNA-DNA-Hybridisierungen 24
2.7 Radioaktive Markierung 24
2.8 DNA-Sequenzierung 24
2.9 Transformation von A. chrysogenum 24
2.10 Bestimmung der mitotischen Stabilität der rekombinanten DNA 24
2.11 Mikrobiologische Bestimmung von Cephalosporin C 25
2.12 Gelelektrophoretische Trennung intakter Chromosomen 25
2.12.1 Präparation intakter Chromosomen 25
2.12.2 Pulsfeld-Gelelektrophorese 25
2.13 Computerprogramme zur DNA-Analyse 26
2.14 Sicherheitsmaßnahmen 26
IV. Ergebnisse 27
1. Genomanalyse durch gelelektrophoretische
Trennung von Chromosomen 27
2. Analysen zur Expression von B-Lactam-Genen 33
2.1 Klonierung von ß-Lactam-Genen aus A. chrysogenum 33
2.2 Transkriptanalysen von ß-Lactam-Genen 35
3. Transformation der Acrernonium-Stamme Ac2 und Ac3 37
3.1 Expression des bakteriellen Hygromycin B-
Phosphotransferase Gens (hph) in A. chrysogenum 38
3.2 Nachweis rekombinanter DNA in A. chrysogenum-Transformanten 39
4. Amplifizierung des pcbC-Gens 42
4.1 Integrative Transformation zur Erhöhung der Kopiezahl 42
4.2 Karyotyp-Analyse transgener Pilze 44
4.3 Expression des amplifizierten pcbC-Gens 48
5. Sequenzspezifische Integration der Vektor-DNA 52
5.1 Transformation mit unterschiedlichen Vektoren 52
5.2 Nachweis Sequenz spezifischer Rekombination 55
5.3 Nachweis des pcbC-Transkriptes 58
V. Diskussion 60
1. Genomanalyse durch gelelektrophoretische
Trennung von Chromosomen 60
1.1 Die Anzahl und Größe der Chromosomen variiert in
Acremonium-Arten und verwandten Semiproduzenten 61
2. Analysen zur Genexpression von 8-Lactam-Genen 65
2.1 Die pcbAB-und pcbC-Gene liegen in A. chrysogenum direkt benachbart vor 65
2.2 Korreliert der Gehalt derpcbC-mRNA mit der
Cephalosporin C-Produktivität? 67
3. Transformation von A. chrysogenum 69
3.1 Expression des bakteriellen hph-Gens in A. chrysogenum
nach heteroleger Integration der rekombinanten DNA 69
4. Die Amplifikation des pcbC-Gens 75
4.1 Methylierungen der rekombinanten DNA können
weitestgehend ausgeschlossen werden 75
4.2 Die rekombinante DNA wird in A. chrysogenum in
Abhängigkeit vom Integrationsort transkribiert 76
5. Sequenzspezifische Integration der Vektor-DNA 79
5.1 Die Rekombinationsprozesse sind von der Länge der
homologen DNA im Vektor abhängig 80
5.2 Das Transkript des pcbC-Gens fehlt in den Transformanten 85
VI. Zusammenfassung 87
VII. Literatur 89
VIII. Anhang 101