cover

Katrin Gessner-Ulrich:

Untersuchungen zur Expression und Funktion des linearen, mitochondrialen Plasmides pC1K1 von Claviceps purpurea

1992. 83 Seiten, 6 Abbildungen, 14x22cm, 210 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 148)

ISBN 978-3-443-59049-9, brosch., price: 31.00 €

in stock and ready to ship

Order form

BibTeX file

Contents

Inhaltsverzeichnis top ↑

1. Einleitung 1
1.1. Die Codierungskapazität linearer Plasmide 1
1.2. Replikation und terminale Proteine linearer DNAs 3
1.3. Funktion linearer Plasmide 7
1.4. Interaktion linearer Plasmide mit mitochondrialer DNA 9
1.5. Lineare Plasmide von Claviceps purpúrea 9
2. Material und Methoden 12
2.1. Bakterienstämme und ihre Anzucht 12
2.2. Claviceps purpurea-Stämme und ihre Anzucht 12
2.3. Plasmide 13
2.4. Primer 13
2.5. Chemikalien und Enzyme 14
2.6. Häufig verwendete Puffer und Lösungen 15
2.7. Präparation von Nukleinsäuren 15
2.7.1. Plasmid-DNA aus Escherichia coli 15
2.7.2. Isolation von mitochondrialer DNA aus Claviceps purpuren 15
2.7.3. Schnellverfahren zur DNA-Isolation aus Claviceps purpuren 15
2.7.4. Isolation von mitochondrialer RNA aus Claviceps purpuren 16
2.7.5. Isolation von Gesamt-RNA aus Claviceps purpúrea 16
2.8. Konstruktion rekombinanten DNA (Klonierungen) 16
2.9. Gelelektrophorese von Nukleinsäuren 17
2.9.1. Gelelektrophorese von DNA 17
2.9.2. Gelelektrophorese von RNA 17
2.10. Hybridisierungen 17
2.10.1. Markierung von DNA 17
2.10.2. Southern-Blots und Hybridisierungen 17
2.10.3. Herstellung strengspezifischer RNA-Sonden 18
2.10.4. Northern-Blots und Hybridisierung 18
2.11. Transkriptstartpunkt-Bestimmung 18
2.12. PCR-Experimente 19
2.13. Isolierung und Analyse von Proteinen 19
2.13.1. Expression und Reinigung rekombinanten Proteine aus Escherichia
coli 19
2.13.2. Herstellung von Antikörpern 20
2.13.3. Präparation von Mitochondrien-Rohextrakten von Claviceps purpuren 20
2.13.4. Auftrennung von Proteinen durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 20
2.13.5. Immunologischer Nachweis immobilisierter Proteine 21
2.13.6. Isolierung des terminalen Proteins 21
2.13.7. Jodierung gereinigter Proteine 21
2.13.8. Komplex-Bildungs-Versuche (Terminales Protein-dNTP) 22
2.14. Infektion von Secale bereale 22
2.15. Fusion von Claviceps purpurea-Protoplasten 22
3. Ergebnisse 24
A: Molekulare Expressionsanalyse des linearen Plasmides pCIK1 24
3.1. Analyse der HaupKranskripte 24
3.1.1. Überprüfung der Strangspezifität 24
3.1.2. Bestimmung der Transkriptstartpunkte von ORF1 und ORF2 27
3.2. Proteinnachweis für ORFI und ORF2 von pCIK1 29
3.2.1. Expression von PlasmidabschniKen in Escherichia colt und Herstellung
von Antiseren 30
3.2.2. Immunologischer Nachweis der Proteinprodukte von ORFI und ORF2
von pCIKI in Claviceps purpuren 33
3.3. Nachweis zusätzlicher Transkripte von pCIK1 36
3.3.1. Transkripte im Bereich von ORF1 und ORF2 36
3.3.2. PCR-Analyse von ORF3 38
3.4. Codierung des terminalen Proteins von pCIK1 41
3.4.1. Aufreinigung des terminalen Proteins für die Sequenzierung 42
3.4.2. Komplex-Bildungs-Versuche 44
3.4.3. Überprüfung des ORF1 als möglichen, das terminale Protein
codierenden PlasmidabschniK 45
B: Untersuchungen zur Funktion von pCIK1 48
3.5. Entstehung und Charakterisierung eines plasmidfreien Derivates vom
Stamm K 48
3.6. Vergleichende Infektionsversuche der Claviceps-Stämme K und K- 50
3.7. Versuche zur Übertragbarkeit linearer, mitochondrialer Plasmide
zwischen verschiedenen C7aviceps-Stämmen 53
3.7.1. Fusionsexperimente mit Claviceps 53
4. Diskussion 56
A: Molekulare Analyse von pCIK1 56
4.1. Expressionsprodukte: Transkripte und Proteine von pCIK1 56
4. 1.1. ORF1- und ORF2-Expressionprodukte 56
4.1.2. Zusätzliche Transkripte von pCIK1 59
4.2. Codierung des terminalen Proteins 61
B: Funktion und Erhaltung von pCIK1 67
4.3. Funktion des linearen Plasmides pCIK1 67
4.4. Übertragbarkeit und Erhaltung linearer mitochondrialer Plasmide 69
5. Zusammenfassung 73
6. Literatur 75