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Sabine Hahnau:

Immunologische Bestimmung des Mycotoxins Cyclopiazonsäure

1993. XII, 169 Seiten, 57 Abbildungen, 29 Tabellen, 14x22cm, 370 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 151)

ISBN 978-3-443-59052-9, brosch., price: 46.00 €

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Contents

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1 Einleitung 1
2 Material und Methoden 15

2.1 Chemikalien, Lösungen und Puffer 15
2.2 Material und Geräte 18
2.3 Biologisches Material 21
2.4 Kulturmedien 23
2.4.1 Medien für die Pilzkultur 23
2.4.2 Medien für die Hybridomkultur 26
2.5 Untersuchungsmaterial 28
2.6 Chemische Synthesen 29
2.6.1 Synthese der Immunogene 29
2.6.2 Synthese von enzymmarkierter Cyclopiazonsäure 30
2.6.2.1 Bestimmung der Enzymaktivität der alkalischen Phosphatase 31
2.6.3 Synthese des CPA-lmins 31
2.7 Massenspektrometrie 32
2.7.1 Chromatographischer und massenspektrometrischer Nachweis des CPA-Imins 33
2.8 Immunisierungen und Blutentnahmen 34
2.8.1 Kaninchen 34
2.8.2 Mäuse 34
2.9 Gewinnung und Reinigung der Antikörper 35
2.9.1 Gewinnung von polyklonalen Antikörpern 35
2.9.2 Gewinnung von monoklonalen Antikörpern 35
2.9.2.1 Präparation der Milz 35
2.9.2.2 Fusion 35
2.9.2.3 Reindarstellung der Myolomlinien (Reklonierungen) 36

2.9.2.4 Bestimmung der Subklassen der monoklonalen Antikörper 36
2.9.3 Verfahren zur Reinigung von Antikörpern 37
2.9.3.1 Rivanol-Ammoniumsulfat-Fällung 37
2.9.3.2 Caprylsäure-Ammoniumsulfat-Fällung 3
2.10 Zellkulturen 38
2.10.1 Dauerkultur von Myelomzellen 38
2.10.2 Dauerkultur von Hybridomzellen 39
2.10.3 Gefrierkonservierung von Zellen 39
2.10.4 Auftauen von gefrierkonservierten Zellen 39
2.11 Pilzkulturen 40
2.11.1 Kulturhaltung der Pilze 40
2.11.2 Fütterung der Pilze mit 3H-Tryptophan 40
2.12. Extraktion der Analyseproben 41
2.12.1 Extraktion von Lebensmitteln und Pilzlichen Agarkulturproben 41

2.12.2 Extraktion von flüssigen Proben 41
2.12.3 Extraktion von Pilzmycel aus Flüssigkulturen 41
2.13 Immunologische Quantifizierung von Cyclopiazonsäure 42
2.13.1 Enzymimmuntest mit polyklonalen Antikörpern 42
2.13.2 Enzymimmuntest mit monoklonalen Antikörpern 44
2.13.3 Enzymimmuntest für die Untersuchung der Pilz-Isolate 45

2.13.4 Berechnung von Nachweis- und Bestimmungsgrenzen nach dem
Eichkurvenverfahren 46
2.14 Physikochemische Verfahren zum Nachweis von Cyclopiazonsäure 48
2.14.1 Dünnschichtchromatographie 48
2.14.2 Chromatographie an C"3-Reversed-Phase-Säulen 48
2.14.3 Hochdruckflüssigkeitschromatographie 49
2.15 Mutagenese der Pilze 50
2.16 Gelelektrophoretische Identifizierung der Pilze 51
2.16.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 52
2.17 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung der Pilze 52
2.17.1 Fixierung der Pilze 52
2.17.2 Goldbedampfung 52
3 Ergebnisse 53
3.1 Charakterisierung und Einsatz polyklonaler Antikörper
gegen Cyclopiazonsäure 53
3.1.1 Immunisierungserfolg 53
3.1.2 Etablierung und Optimierung eines Enzymimmuntests mit
polyklonalen Antikörpern 57
3.2 Charakterisierung und Einsatz monoklonaler Antikörper gegen
Cyclopiazonsäure 65
3.2.1 Fusionierungserfolg 65
3.2.2 Etablierung und Optimierung eines Enzymimmuntests mit
monoklonalen Antikörpern 71

3.3 Meßwertekorrelation von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern 78

3.4 Nachweis und Reinigung von Cyclopiazonsäure mit physikochemischen
Verfahren 79
3.4.1 Nachweis von Cyclopiazonsäure mittels Dünnschichtchromatographie 79

3.4.2 Reinigung von cyclopiazonsäurehaltigen Extrakten
mittels Chromatographie an C18-Reversed Phase-Säulen 81
3.4.3 Nachweis von Cyclopiazonsäure mittels
Hochdruckflüssigkeitschromatographie 82
3.5 Untersuchungen zur Qualität der Probenextraktion 93
3.5.1 Wiederfindung von zugesetzten Cyclopiazonsäure 94
3.5.2 Haltbarkeit von Cyclopiazonsäure im Agarmedium 96
3.6 Analyse von Pilzextrakten 96
3.6.1 Cyclopiazonsäure-Produktion verschiedener Pilzstämme 96
3.6.2 Untersuchung von Matrixeffekten 98
3.6.3 Verteilung der Cyclopiazonsäure in Pilz-Plattenkulturen 99
3.6.4 Abhängigkeit der Cyclopiazonsäure-Produktion der
Pilze vom Nährstoffangebot und anderen Faktoren 101
3.6.5 Cyclopiazonsäure-Produktion der Pilze in flüssigen Nährmedien 102
3.7 Analyse von Lebensmitteln 103
3.7.1 Cyclopiazonsäuregehalt in Lebensmitteln 104
3.7.2 Cyclopiazonsäuregehalt in Weißschimmelkäse 1O9
3.7.3 Ableitung von Nachweis- und Bestimmungsgrenzen nach dem
Eichkurvenverfahren 113
3.8 Mutagenese von Penicillium camemberti, Stamm Sp 438 119
3.8.1 Überlebensraten der Sporen 120
3.8.2 Einfluß von Natriumdesoxycholat auf das Sporenwachstum 121
3.8.3 Cyclopiazonsäureproduktion der mutagenbehandelten Isolate von
P. camemberti. Sp 438 122
3.9 Identifizierung der Pilze 125
3.9.1 Morphologische Charakterisierung der Pilze 125
3.9.2 Kultivierung von Mutante 366 auf
p-Fluoro-DL-Phenylalaninhaltigem Medium 126
3.9.3 Gelelektrophoretische Identifizierung der Pilze 132
3.9.4 Rasterelektronenmikroskopische Identifizierung der Pilze 133
3.10 Darstellung der Stoffwechselprodukte von Mutante 366 137
3.10.1 3H-Tryptophan-Fütterung von Penicillium camemberti. Sp 438 137
3.10.2 Stoffwechselprodukte von Mutante 366 139
4 Diskussion 141
Zusammenfassung 155
6 Anhang 156
7 Literaturverzeichnis 161