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Stefanie Faßbender:

Intron-kodierte Polypeptide aus Chloroplasten und Mitochondrien

1993. 132 Seiten, 24 Abbildungen, 10 Tabellen, 14x22cm, 320 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 152)

ISBN 978-3-443-59053-6, brosch., price: 46.00 €

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Contents

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I. Einführung 1
1. Einleitung 1
2. Intron-kodierte Maturasen sind wichtige Ko-Faktoren beim
RNA-Spleißen 2
3. Intron-kodierte Endenukleasen verursachen die Mobilität ihres
eigenen Introns 5
3.1 Das Omega System 5
3.2 Intron-Mobilität ist ein Merkmal vieler Gruppe I Intronen 6
3.3 Das Initiationsereignis für den Intron-Transfer
ist ein Doppelstrang-Bruch 9
4. Intron-kodierte Polypeptide aus Gruppe II Intronen weisen
Sequenzähnlichkeiten zu Reversen Transkriptasen auf 11
4.1 Mutmaßliche Intron-kodierte Reverse Transkriptasen verursachen die
Transposition oder Deletion von Intronen 13
4.2 Reverse Transkriptase kodierende Intronen können als
frei replizierende Plasmide existieren 14
5. Hypothesen über den evolutionären Ursprung Intron-kodierter
Polypeptide 17
5.1 Mobile genetische Elemente sind die Vorfahren von Intronen 17
5.2 Präexistierende Intronen haben offene Leserahmen aufgenommen 19
5.2.1 Die Evolution struktureller und Codierender Intron-Regionen
erfolgte unabhängig voneinander 19
5.2.2 Endonuklease- und Reverse Transkriptase-Leserahmen kommen
auch außerhalb von Intronen vor 20
5.2.3 Intron-kodierte EndonuLleasen und Reverse Transkriptasen
haben sich sekundär zu Maturasen entwickelt 22
6. Zusammenfassung und Ausblick 23
II. Problemstellung 24
III. Material und Methoden 28
1. Material 28
1.1 Stämme 2X
1.2 Nährmedien 28
1.3 Chemikalien 29
1.4 Enzyme 29
1.5 Häufig verwendete Puffer 30
1.6 Plasmide 30
1.7 Oligonukleotide 32
2. Methoden 33
2.1 Kulturbedingungen 33
2.2 Isolierung von Nukleinsäuren 33
2.3 Gelelektrophorese 34
2.4 Transformationen 34
2.5 Southern-Blots und DNA-DNA-Hybridisierungen 34
2.6 Northern-Blots und RNA-DNA Hybridisierungen 34
2.7 Radioaktive Markierung von DNA 35
2.8 Polymerase-Ketten-Reaktion - PCR 35
2.9 In vitro Rekombination von DNA 35
2.9.1 Klonierung in Plasmide 35
2.9.2 Klonierung von PCR-Fragmenten in Expressions-Vektoren 35
2.10 Oligonukleotidsynthese 35
2.11 DNA-Sequenzierung 35
2.12 Gen-Uberexpression in Escherichia coli 35
2.13 In viro Test zur Uberprüfung der Endonuklease-Aktivität
Intron-kodierter Polypeptide 36
2.14 In vitro Transkription 36
2.15 In vitro Transtation 36
2.16 In vitro-Überprüfung von Endonuklease-Aktivität 37
2.17 Heterologe Genexpression in S. cerevisine 37
2.17.1 Methodische Grundlagen zur heterologen Genexpression
mit dem Ty-System 37
2.17.2 Aufreinigung von Ty Virus-ähnlichen Partikeln (TyVLPs) aus
S. cerevisine 38
2.18 Identifizierung von Proteinen durch Reaktion mit spezifischen
Antikörpern 39
2.19 Reverse Transkriptase-Messung 39
2.20 Geltest zur Darstellung der Reverse Transkriptase-Aktivität 39
2.21 Sicherheitsmaßnahmen 39
IV. Ergebnisse 40
A. Expressions- und Funktionsanalysen Intron-kodierter Endonukleasen 40
1. Nachweis der heterologen Expression des Intron-kodierten
Polypeptids aus Chlumydomonas smithii in E. coli 40
1.1 Konstruktion rekombinanter pT7-7 Plasmide zur Uberexpression
der Intron-kodierten Endonuklease in E. coli 40
1.2 Spezifische Protein-Markierung 42
2. Funktionsanalyse des Intron-kodierten Proteins aus dem
mitochondrialen cob-Gen von C. smithii 43
2.1 Klonierung der Erkennungssequenz für die mutmaßliche
Intron-kodierte Endonuklease in den Vektor pGP1-2 44
2.2 Expression des Intron-kodierten Proteins mit dem Tabor-System
in Anwesenheit der Erkennungssequenz 44
2.3 Funktionsanalyse des in vitro translatierten
Intron-kodierten Proteins aus C. smithii 46
2.3.1 In vitro Translation des Intron-kodierten Polypeptids 46
2.3.2 Uberprüfung der Endonuklease-Aktivität der in vitro
translatierten Intron-kodierten Proteine 47
2.4 Expression der Intron-kodierten Endonuklease aus C. smithii
unter der transkriptionellen Kontrolle des trc-Promotors 49
2.5 In vivo Nachweis der Endonuklease-Aktivität des Intron-kodierten
Polypeptids aus C. smithii in E. coli 49
3. Endonuklease-Aktivität des Intron-kodierten Polypeptids aus dem
plastidären LSUrRNA-Intron von C. reinhardtli 52
3.1 Nachweis der Endonuklease-Aktivität von I-Crel nach
Expression unter der Kontrolle des trc-Promotors 52
3.2 Die Aktivität von I-CreI kann durch Expression
mit dem pUHE-System gesteigert werden 55
B. Expressions- und Funktionsanalysen Intron-kodierter Reverser
Transkriptasen 57
1. Verbreitung des plastidären petD-Intron-Leserahmens
in der Algengattung Scenedesmus 57
2. Ein Intron-kodiertes Polypeptid kann mit dem Ty-Expressionssystem
in S. cerevisiae heterolog exprimiert werden 58
2.1 Konstruktion der in den Expressionsversuchen eingesetzten Vektoren 58
2.2 Transkriptanalyse des Fusionsgens aus dem TYA-Gen und
dem Intron-kodierten Polypeptid in S. cerevisine 60
2.3 Expression des Intron-kodierten Proteins aus S. obliquus
als TYA-Fusionsprotein in S. cerevisiae 61
3. Heterologe Expression putativer Reverser Transkriptasen
mit dem TY-Expressionssystem in S. cerevislae 62
3.1. Klonierung der mutmaßlichen Reversen Transkriptasen
in den Hefeexpressionsvektor pFM2IIBgllI 62
3.1.1 Konstruktion des Plasmids pSOB148 63
3.1.2 Konstruktion der Plasmide pCRB9 und pCRB11 63
3.1.3 Konstruktion des Plasmids pPA405 64
3.2 Heterologe Expression der verschiedenen mutmaßlichen
Reversen Transkriptasen in S. cerevisiae 64
4. Funktionsanalyse der mutmaßlichen Reversen Transkriptasen 66
4.1 Messung der Reverse Transkriptase-Aktivität der überexprimierten
Polypeptide 66
4.2 Biochemische Charakterisierung der Reverse Transkriptase-Aktivität
des Intron-kodierten Polypeptids aus Podospora anserina 71
4.2.1 Aktivität des Intron-kodierten Enzyms unter Einfluß von N-Ethylmaleimid 71
4.2.2 Effekt von Didesoxythymidin Triphosphat auf die
Reverse Transkriptase-Aktivität des Intron-kodierten Proteins 72
4.2.3 Einfluß von Aphidicolin auf die Polymerase-Aktivität
des Intron-kodierten Proteins 74
V. Diskussion 76
A. Heterologe Expression und Funktionsanalysen Intron-kodierter
Endonukleasen 76
1. Analyse des Intron-kodierten Polypeptids aus dem mitochondrialen
cob-Gen von C. smifhii 77
1.1 Die Intron-kodierte Endonuklease aus dem Chondriom von C. smithli
kann in E. coli heterolog überexprimiert werden 78
1.2 Die Expression des Intron-kodierten Proteins mit dem
T7-RNA-Polymerase-Promotorsystem ist für E. coli-Zellen letal, wenn
sie die Erkennungssequenz der mutmaßlichen Endonuklease enthalten 79
1.3 Das in vitro translatierte Intron-kodierte Polypeptid aus C. smithii
besitzt eine schwache Endonuklease-Aktivität 82
1.4 Die heterolog exprimierte Endonuklease I-Csml hydrolysiert in vivo
das intronfreie cob-Gen aus C. reinhardtii 83