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Uta Jungehülsing:

Genomanalyse bei Claviceps purpurea

[Genome analysis of Claviceps purpurea]

1995. VIII, 135 Seiten, 50 Abbildungen, 23 Tabellen, 14x22cm, 330 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 161)

ISBN 978-3-443-59063-5, brosch., price: 61.00 €

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Contents

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1 Einleitung 1

1.1 Genetische Charakterisierung von Pilzisolaten 1
1.1.1 Molekulare Marker 2
1.1.1.1 Isoenzyme 2

1.1.1.2 Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) 2
1.1.1.3 Random amplified polymorphic DNA (RAPD) 3
1.1.2 Erstellung von Genkarten 5
1.2 Karyotyp-Analyse 6
1.2.1 Prinzip der Puisfeld-Gelelektrophorese (PFGE) 7
1.2.2 Karyotypen einiger Pilzspezies 8
1.3 DNA-Gehalt und Ploidiegrad 11
1.4 Stammbaum-Analysen mittels "Parsimony" 12
1.4.1 Fitch- und Wagner-"Parsimony" 12
1.4.2 Dollo-"Parsimony" 12
1.4.3 Such-Kriterien 13
1.4.4 "Bootstrap"-Analyse 15
1.5 Claviceps purpurea 16
1.5.1 Allgemeine Charakteristika 16
1.5.2 Lebenszyklus 17
1.5.3 Wirtsspezifität und Rassenbildung bei Claviceps purpurea 18
1.5.4 Genetische Aspekte von Claviceps purpurea 19
1.6 Aufgabenstellung 20
2 Material und Methoden 22
2.1 Stämme 22
2.1.1 Claviceps-Stämme 22
2.1.2 Bakterien 24
2.1.3 Roggen 24
2.2 Plasmide 24
2.3 Primer für PCR-Experimente 24
2.4 Chemikalien und Enzyme 25
2.5 Häufig benutzte Puffer und Lösungen 26
2.6 Präparation von DNA 26
2.6.1 Plasmid-DNA aus E. coli 26

2.6.2 Genomische DNA aus C. purpurea 27
2.7 Transformation 27
2.8 Chromosomenpräparation 27
2.9 PCR-Experimente 28
2.10 Gelelektrophoresen 28
2.10.1 Plasmid- und chromosomale DNA 28
2.10.2 PCR-amplifizierte DNA 28
2.10.3 Chromosomen 28
2.11 Southernblots 29
2.11.1 Kapillar-Blotting 29
2.11.2 Vakuum-Blotting 29
2.12 DNA-Elution aus Agarosegelen 29
2.13 DNA-Markierung 29
2.14 Hybridisierung 30
2.15 Herstellung Benomyl-resistenter Isolate von C. purpurea 30
2.16 Kernfärbungen 30
2.16.1 Herstellung von Objektträger-Kulturen 30
2.16.2 Fixierung von Pilzmaterial 30
2.17 DNA-Gehalts-Bestimmungen 30
2.18 Infektion von S. cereale 31
2.19 Keimratenbestimmung 31
2.20 Isolation von Ascosporen 31
2.21 Programme zur Daten-Analyse 31
2.21.1 Kopplungsanalyse der molekularen und phanotypischen Merkmale 31
2.21.2 Stammbaum-Analyse mittels PAUP 33
3 Ergebnisse 34
3.1 RAPD-Analysen 34
3.1.1 Bedingungen für die PCR 34
3.1.1.1 DNA-Qualität 34
3.1.1.2 Taq-Polymerasen 34
3.1.1.3 PCR-Programm 35
3.1.1.4 Thermocycler 35
3.1.1.5 Primer-Anbindung 36
3.1.2 RAPD-Experimente mit verschiedenen Wildisolaten von C. purpurea 36
3.1.3 RAPD-Experimente mit neuen Feldisolaten von C. purpurea 42
3.1.4 Analyse der RAPD-Banden 43
3.2 DNA-Gehalt 48
3.3 Karyotyp-Analyse bei C. parqurea 50
3.3.1 Chromosomenpraparation 50
3.3.2 Bestimmung des Karyotyps verschiedener C. parqurea-Stamme 50
3.3.3 Karyotyp- und RAPD-Analyse verschiedener Benomyl-Isolate 55
3.3.4 Lokalisation bekannter Gene auf Chromosomen von C. purpurea 57
3.4 Infektionsversuche mit verschiedenen C. purpurea-Stämmen 61
3.5 Kreuzung zweier C. purpurea-Stämme 63
3.5.1 Markierung der Eltern 63
3.5.2 Infektion des Roggens mit den Eltern und anschliellende
Isolation von Ascosporen 63
3.5.3 Resistenzverhalten der Nachkommen 64
3.5.4 Karyotyp- und Southern-Analyse der Nachkommen 66
3.5.5 RAPD-Analyse der Nachkommen 71
3.5.6 Versuch zur Erstellung einer Genkarte 75
4 Diskussion 83
4.1 Analyse der RAPD-Methode 83
4.1.1 Analyse mit eluierten RAPD-Banden 84
4.2 Charakterisierung von C. purqurea-Isolaten mittels RAPD 85
4.3 Erstellung phylogenetischer Stammbaume mittels PAUP 85
4.3.1 Phylogenetische Verwandtschaftsverhältnisse verschiedener
C. purqurea-Isolate 88
4.3.2 Zuverlässigkeit der phylogenetischen Verwandtschaft 91
4.4 Untersuchungen zur Virulenz verschiedener C. purpurea-Isolate 94
4.4.1 Variationen in der Sklerotiengröße 96
4.5 Charakterisirung verschiedener C. purpurea-Isolate mittels PFGE 97
4.6 Charakterisirung verschiedener C. purparea-Isolate
über den relativen DNA-Gehelt und Ploidiestufen 100
4.7 Kreuzung von C. purpurea-Stamm T5/B17R mit Bi/P5-1 102
4.8 Kopplungsanalyse der RAPD-Marker 104
4.9 Variabilität bei C. purpurea 108
4.10 Ausblick 109
5 Zusammenfassung 110
6 Literatur 112
7 Anhang 123