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Volker R. Stoldt:

Morphogenese des humanpathogenen Pilzes Candida albicans

Isolierung und Charakterisierung der Gene EFGI und RFGI

[Morphogenesis of the human pathogenic fungus Candida albicans. Isolation and characterization of the EFGI and RFGI genes]

1995. III, 86 Seiten, 23 Abbildungen, 8 Tabellen, 14x22cm, 250 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 162)

ISBN 978-3-443-59064-2, brosch., price: 31.00 €

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Contents

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1. EINLEITUNG 1
2. MATERIAL UND METHODEN 9
2.1. Material 9
2.1.1. Chemikalien und Enzyme 9
2.1.2. Stärnme und Medien 9
2.1.2.1. Escherichia coli-Stämme 9
2.1.2. 2. Hefestämme und Medien 10
2.1.3. Synthetische DNA-Oligos 11
2.1.4. Plasmide 11
2.1.4.1. Grundvektoren 11
2.1.4.2. Plasmidkonstruktionen 12
2.1.4.3. Genbank 13
2.2. Methoden 14
2.2.1. Transfomation 14
2.2.2. Nukleinsäure-Präparation 14
2.2.2.1. Präparation von DNA 14
2.2.2.2. Präparation von RNA 15
2.2.3. Bestirnrnung von Nukleinsäure-Konzentrationen 15
2.2.4. DNA-Restriktion 15
2.2.5. AuRrennung von DNA-Fragrnenten durch Gelelektrophorese 15
2.2.6. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 15
2.2.7. DNA-Ligation 15
2.2.8. Auffüllen überstehender 5'-DNA-Enden 16
2.2.9. DNA-Dephosphorylierung 16
2.2.10. Markierung von DNA 16
2.2.11. Nachweis spezifischer DNA- bzw. RNA-Sequenzen 16
2.2.1 1.1. Southern-Analyse 16
2.2.11.2. Northern-Analyse 17
2.2.12. DNA-Sequenzierung 17
2.2.13. Autoradiographie 17
2.2.14. Bestimmug des Transkriptionsstarts 18
2.2.14.1. Fragmentmarkierung 18
2.2.14.2. S1-Reaktionsansatz 18
2.2.15. Induktion der Hyphenbildung bei C. albicans 19
Ergebnisse 20
3.1. Suche nach Genen, die an der Hyphenmorphogenese von C albicans
beteiligt sind 20
3.1.1. Genbanken 20
3.1.2. C. albicons Gene regulieren das PseudoLyphenwachstum von
S. cerevisine 21
3.1.2.1. S. cerevisine Stammkonstruktion 21
3.1.2.2. Pseudohyphenwachstum von S. cerevisiae Transformanten 22
3. 1.2.3. Suche nach Genen, die die Pseudohyphenbildung unterdrücken 24
3.1.2.4. Die morphologischen Phänotypen der Klone in S. cerevisiae 25
3.1.3. Versuche zur Überexpression von Genen in C. albicans 26
3.2. Sequenzanalysen der Gene EFGI und RFGI 28
3.2.1. EFGI 28
3.2.1.1. Sequenzierung des Pseudohyphen-auslösenden Gens 28
3.2.1.2. Phänotyp der Subklone 29
3.2.1.3. DNA-Sequenz 30
3.2.1.4. Aminosäuresequenz von Efg1p 33
3.2.1.5. Homologe Proteine zu Efg1p 34
3.2.1.6. Homologe Gene zu EFG1 in anderen Pilzen 36
3.2.1. 7. Untersuchung der homologen ACS 38
3.2.1.8. Transkriptionsstart im EFGI 39
3.2.2. RFGI 41
3.2.2.1. Sequenzierung des Plasmidklons 41
3.2.2.2. Homologien zu Rfg1p 44
3.3. Physiologie 45
3.3.1. Physiologie der Pseudohyphenbildung in S. cerevisine 45
3.3.1.1. Ammonium-abhängiges Pseudohyphenwachstum 45
3.3.1.2. Kohlensqtoff-abhängiges Pseudohyphenwachstum 47
3.3.2. Expression von EFG1 und RFG1 in C. albicans 47
3.3.2.1. Überexpression von EFG und RFG1 48
3.3.2.2. Transkriptregulation von EFG1 und RFG1 während der
Morphogenese 48
4. DISKUSSION 54
4.1. C albicans Gene können die Morphogenese von S. cerevisiae regulieren 54
4.2. Isolierung und Charakterisierung des EFG1 55
4.2.1. Isolierte EFGl-Plasmide und ihre Phänotypen in S. cerevisiae 55
4.2.2. ACS am 3'-Ende des EFGI und deren ARS-Funktion 55
4.2.3. Transkriptionsinitiation von EFG1 56
4.2.4. Funktionelle Domänen des Efg1p 57
4.2.5. Physiologie der Pseudohyphenbildung von S. cerevisiae 60
4.2.6. Funktion des Efglp in der Morphogenese 63
4.3. Pleiotroper Phänotyp von RFG1 64
4.4. EFC1 und RFG1 in C albicans 67
4.4.1. EFG1 und RFG1 im Phasenwechsel 68
4.4.2. EFG1 während des "Phenotypic Switching" 69
4.5. Modell zur Funktion des EFGI in der Morphogenese von C albicans und
S. cerevisiae 72
4.6. Schwach Imprimierte Gene verändern nicht die Morphologie in C
albicans 73
5. ZUSAMMENFASSUNG 74
6. LITERATUR 75
7. ABKÜRZUNGEN 86