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Jürgen Schründer:

Cytoplasmatische Vektoren zur heterologen Genexpression bei Hefen

Konstruktion und Analyse linearer Hybridplasmide basierend auf dem Killer-System der Hefe Kluyveromyces lactis

1996. 141 Seiten, 44 Abbildungen, 15 Tabellen, 14x22cm, 310 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 163)

ISBN 978-3-443-59065-9, brosch., price: 46.00 €

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Keywords

MykologieHefeKluyveromyces lactisMikroorganismusCytoplasmaheterolog

Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

Die Ergebnisse der durchgeführten Experimente zeigen, daß sich die cytoplasmatisch lokalisierten, linearen Killerplasmide der Hefe Kluyveromyces lactis prinzipiell zur Etablierung eines kernunabhängigen Expressionssystems eignen.

Mit den konstruierten, linearen Hybridplasmiden konnte beispielhaft die Expression von drei biotechnologisch relevanten Proteinen, der Glucose-Dehydrogenase A aus Bacillus megaterium, der Uridindiphospho-Glucose-Dehydrogenase aus Streptococcus pyogenes und der Xylose-Isomerase aus Streptonryces rubiginosus, unter Kontrolle des cytoplasmatischen Transkriptionsapparats gezeigt werden.

Für die Glucose-Dehydrogenase A erwies sich dabei ein willkürlich vor das heterologe Gen kloniertes, 97 Basenpaare großes Sequenzmotiv - das das cytoplasmatische Promotorelement UCS5 enthält - als ausreichend um eine meßbare Expression in der rekombinanten Hefe zu ermöglichen.

Auch bei der Expression der Uridindiphospho-Glucose-Dehydrogenase in K. lactis wurde eine geringere spezifische Aktivität des Enzyms relativ zu der in einem bakteriellen System bestimmt.

Der Nachweis der, durch ein Hybridplasmid kodierten, biologisch aktiven Xylose-Isomerase verdeutlicht, daß auch hoch G/C-reiche Gensequenzen (71% G/C) mit den linearen Killerplasmiden (die selbst mit 27% einen nur geringen G/C-Gehalt aufweisen) als Vektorsystem exprimiert werden können.

Durch die in dieser Arbeit gezeigte hohe Stabilität der rekombinanten Plasmide auch ohne Selektionsdruck, sowie durch die Möglichkeit, diese linearen Hybridvektoren auf andere Hefen (wie z.B. Saccharvmyces cerevisiae) zu übertragen, ist das etablierte Expressionssystem trotz seiner geringen Expressionseffizienz nicht nur für biotechnologische Produktionszwecke interessant, sondern könnte auch bei der Bearbeitung grundlegender Fragestellungen zur Genexpression in Hefen von Nutzen sein.

Content Description top ↑

The results of the described experiments clearly demonstrate the suitablility of the cytoplasmic localized linear killer plasmids of the yeast Kluyveromyces lactis as an extranuclear expression system.

After optimizing an in vivo recombination vector, homologous integration of heterologous genes occured at a predicted position in open reading frame 2 (ORF2) which is located on the smaller plasmid pGKL1 and which is not essential for the replication and maintenance of the killer system.

Concerning the glucose dehydrogenase, a 97 basepairs spanning sequence motif (including the cytoplasmic promoter element UCS5) was placed arbitrarily in front of the gene; it was sufficient to detect a measurable expression in the recombinant yeast.

Similarly, for the uridinediphospho glucose dehydrogenase only a moderate specific activity of the enzyme in K. lactis could be determined compared to a bacterial system.

With the expression of a biologically active xylose isomerase from a linear hybrid plasmid the ability of the killer system to express G/C rich gene sequences is proven (G/C content of the xylose isomerase: 71%); the killer plasmids themselves have a G/C content of 27% only.

Due to the high stability of the recombinant plasmids even without any selective pressure, and taking also into account that the hybrid vectors can be transferred into several other yeast species (e.g. Saccharomyces cerevisiae), the established expression systems may, in spite of its moderate expression efficiency, not only be of interest for the biotechnologically production of heterologous proteins but they could also be used to adress general questions concerning gene expression in yeast.

Inhaltsverzeichnis top ↑

KAPITEL 1
EINLEITUNG
1.1 Vektorsysteme zur heterologen Genexpression in Hefen 1
1.1.1 Integrative Vektoren 1
1.1.2 Episomale Vektoren 3
1.2 Lineare Plasmide bei Mikroorganismen 7
1.2.1 Vorkommen und phänatypisches ErscheiDungsbild 7
1.2.2 Strukturmerkmale und Replikation 10
1.2.3 Phylogenetische Verwandtschaftsbeziehungen 12
1.3 Die linearen Killerplasmide der Hefe Klvyveromyces laclis 14
1.3.1 Genomorganisation 15
1.3.2 Replikation 17
1.3.3 Der Killer-Phänotyp 17
1.3.4 Cytoplasmatische Transkriptionssignale 19
1.3.5 Transfer in andere Hefen 22
1.4 Rekombination der Killerplasmide mit Fremd-DNA 22
1.4.1 In vitro Integration heteroleger Gene 22
1.4.2 In vivo Rekombinationstechnik 23
1.5 Ziel der Arbeit 26
KAPITEL 2: MATERIAL UND METHODEN
2.1 Mikroorganismen und Klonierungssysteme 27
2.2 Nährmedien und Kulturbedingungen 31
2.2.1 Anzucht von Escherichia coli 31
2.2.2 Anzucht von Kluyveromyces laclis und Saccharornyces cerevisiae 31
2.3 Methoden zur DNA-Präparation 32
2.3.1 Plasmid-Isolierung aus Escherichia coli 32
2.3.2 Isolation von DNA aus M13-Phagen 33
2.3.3 Gesamt-DNA-Isolierung aus Hefen 34
2.3.4 Schnellmethode zur Gesamt-DNA-Präparation 35
2.3.5 Isolierung von linearen, Protein-assoziierten Plasmiden aus Hefen 35
2.3.6 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen 36
2.4 Aufreinigung und Fällung von DNA 37
2.4.1 Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion 37
2.4.2 Alkoholpräzipitation 37
2.4.3 Dialyse von DNA-Proben 37
2.5 Elektrophorese von DesoXyribonukleinsäuren 38
2.5.1 Agarosegelelektrophorese 38
2.5.2 Rückgewinnung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 39
2.6 Modifikation und Klonierung von DNA 39
2.6.1 Restriktion 39
2.6.2 Auffullen überstehender 5' Enden 39
2.6.3 Enzymatischer Abbau 3' überstehender Enden 40
2.6.4 Dephosphorylierung 40
2.6.5 Ligation 41
2.6.6 Escherichia coli TransLormationsmethoden 41
2.6.7 Hefe-Transformation 42
2.6.8 Protoplastentusion bei Hefen 43
2.7 Hybridisierungstechniken 44
2.7.1 DNA-Transfer auf Nylonmembranen 44
2.7.2 Markierung der DNA-Sonden 44
2.7.3 DNA-DNA-Hybridisierung 45
2.7.4 Immunologischer Nachweis 45
2.8 Polymerasekettenreaktion (PCR) 46
2.9 DNA-Sequenzierung 47
2.9.1 Sequenzierungsreaktion 48
2.9.2 Polyacrylamidgelelektrophorese und Autoradiographie 49
2.10 Bestimmung der Enzymaktivitäten 50
2.10.1 Glucose-Dehydrogenase A 50
2.10.2 Xylose-Isomerase 52
2.10.3 WP-Glucose-Dehydrogenase 55
2.11 Platten-Test zur Identifizierung des Killerphänotyps bei Hefen 56
2.12 Sicherheitsbestimmungen 56
KAPITEL 3: ERGEBNISSE
3.1 Optimierung des in vivo Rekombinations-Systems zur Konstruktion linearer
Hybridplasmide 57
3.1.1 Generation einer zusätzlichen singulären
RestriktionsendonuLlease-Erkennungssequenz zur Integration heterologer
DNA 58

3.1.2 Integration einer multiplen Klonierungsstelle in den in vivo
Rekombinations-Basisvektor 61
3.2 Cytoplasmatische Expression des Glucose-Dehydrogenase A-Gens aus
Bacillus megaterium in Hefen 63
3.2.1 Konstruktion eines linearen Hybridplasmids mit cytoplasmatischem
Promotorelement nicht in Phase 64
3.2.1.1 Bestimmung der enzymatischen Aktivität der
Glucose-Dehydrogenase A 70

3.2.2 In Phase Fusion des cytoplasmatischen Promotorelements (UCS5) mit dem
Glucose-Dehydrogenase-Gen 71
3.2.2.1 Transtormation von Kluyveron?yces lactis und Bestimmung der
spezifischen Enzym-Aktivität 77
3.2.2.2 Expression der Glucose-Dehydrogenase in Saccharomyces
cerovisine 81
3.3 Cytoplasmatische Expression des Xylose-Isomerase-Gens aus Streptomyces
rubiginosus 84
3.3.1 In vitro Konstruktion eines in vivo Rekombinationsvektors 85
3.3.2 Transformation von Saccharomyces cerevislne und in vivo
Rekombination 90
3.3.3 Nachweis der cytoplasmatischen Expression der Xylose-Isomerase 91
3.4 Heterologe Expression einer Uridindiphospho-Glucose-Dehydrogenase
aus Streptococcus pyogenes 96
3.4.1 Klonierung des in vivo Rekombinationsvektors 97
3.4.2 In vivo Rekombination zur Integration des hasB-Gens in das
lineare Killerplasmid pGKLI 102
3.4.3 Bestimmung der spezifischen Aktivität der cytoplasmatisch exprimierten
UDP-Glucose-Dehydrogenase 103
KAPITEL 4: DISKUSSION
4.1 Heterologe Genexpression auf der Basis der linearen Killerplasmide von
Kluyveromyces laclis 105
4.1.1 Das Glucose-Dehydrogenase A-Gen aus Bacillus megaterium 105
4.1.2 Das Xylose-Isomerase-Gen aus Streptomyces rubiginosus 109
4.1.3 Das UDP-Glucose-Dehydrogenase-Gen aus Streptococcus pyogenes 111
4.1.4 Bewertung des cytoplasmatischen Expressionssystems 113
4.2 Die Glucose-Dehydrogenase als Reportergen zur vergleichenden Analyse
cytoplasmatischer Promotorelemente 114
4.3 Ausblick 118
ZUSAMMENFASSUNG 119
SUMMARY 120
VORVERÖFFENTLICHUNGEN 121
LITERATURVERZEICHNIS 122
ANHANG 139