cover

Renate Radzio:

Heterologe Genexpression in dem Cephalosporin C produzierenden Hyphenpilz Acremonium chrysogenum

1997. 112 Seiten, 20 Abbildungen, 6 Tabellen, 14x22cm, 280 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 164)

ISBN 978-3-443-59066-6, brosch., price: 41.00 €

in stock and ready to ship

Order form

BibTeX file

Keywords

GenheterologCephalosporinHyphenpilzMykologieEnzymBiotechnologie

Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

In der vorliegenden Arbeit werden Analysen zur heterologen Genexpression in dem biotechnologisch relevanten Hyphenpilz Acremonium chrysogenum vorgestellt. Zur Kontrolle der heterologen Genexpression wurde der homologe pcbC Promotor eingesetzt, der Teil eines Biosynthesegens des ß-Lactam-Antibiotikums Cephalosporin C ist. Der Promotor wurde einer funktionellen Analyse unterzogen und anschließend zur Entwicklung eines Systems zur Expression heterologer Gene in A. chrysogenum eingesetzt, das anhand eines eukaryontischen Modellgens etabliert wurde.

Inhaltsverzeichnis top ↑

1. Einleitung 1
1.1 Einsatz von Hyphenpilzen in der konventionellen Biotechnologie 2
1.2 Expression heteroleger Gene in Hyphenpilzen 5
1.2.1 Transformation 6
1.2.2 Struktur pilzlieber Expressionssysteme 7
1.2.3 Posttranslationale Modifikationen 10
1.2.4 Wirtsorganismen zur heterologen Genexpression 11
1.3 Anwendungen der heterologen Genexpression 12
1.3.1 Modifikation von Stoffwechselwegen 13
1.3.2 Überproduktion heteroleger Proteine 15
1.4 Ausblick 18
2. Problemstellung 19
3. Material und Methoden 23
3.1 Material 23
3.1.1 Stämme 23
3.1.2 Nährmedien 23
3.1.3 Chemikalien 23
3.1.4 Enzyme 24
3.1.5 Häufig verwendete Puffer 24
3.1.6 Plasmide 25
3.1.7 Oligonukleotide 26
3.2 Methoden 27
3.2.1 Kulturbedingungen 27
3.2.2 Transformationen 27
3.2.3 Isolierung von Nukleinsäuren 2 8
3.2.4 Gelelektrophorese 29
3.2.5 Southern Blots und DNA-DNA-Hybridisierungen 29
3.2.6 Northern Blots und DNA-RNA-Hybridisierungen 29

3.2.7 Radioaktive Markierung von DNA 30
3.2.8 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 30
3.2.9 Deletion mit ExonuLlease III/Nuklease S1 30
3.2.10 DNA-Sequenzierung 30
3.2.11 Oligonukleotidsynthese 31
3.2.12 In vitro Rekombination von DNA 31
3.2.13 Nachweis der Reportergen-Expression 31
3.2.13.1 Halbquantitative Bestimmung der ß-Galaktosidase-Expression 31

3.2.13.2 Quantitative Bestimmung der ß-(3-Galaktosidase-Expression 31
3.2.14 Bestimmung der Proteinkonzentration 32
3.2.15 Analyse von DNA-Protein-Interaktionen durch Gelretentionstests 32
3.2.16 Nachweis von rekombinantem Hirudin 33
3.2.16.1 Enzymatischer Nachweis der Hirudin-Aktivität 33
3.2.16.2 Nachweis von Hirudin durch Festphasen-Enzymimmuntests
(ELI SA) 3 3
3.2.16.3 Detektion von Hirudin durch Immunoblots 34
3.2.17 Sicherheitsbestimmungen 34
4. Ergebnisse 35
4.1 Funktionsanalyse dcs pcbC Promotors aus Acremonium chrysogenum 35
4.1.1 Konstruktion von Vektoren zur Reportergenanalyse des pcbC Promotors 35
4.1.2 Kotransformation von A. chrysogenum und molekulare
Charakterisierung der Transformanten 38
4.1.3 Identillzierung funktioneller Sequenzen des pcbC Promotors durch
Analyse der Reportergenexpression 41
4.1.4 Nachweis von DNA-Protein-Interaktionen in einem potentiell
regulatorisch wirksamen Sequenzbereich des pcbC Promotors 45
4.2 Anwendung des pcbC Promotors zur Expression eines heterologen
eukaryontischen Gens in Acremonium chrysogenum 49
4.2.1 Konstruktion von Vektoren zur Synthese des Modellproteins
Hirudin in Acremonium chrysogenum 49
4.2.2 Molekulare Charakterisierung der Kotransformanten zur
Hirudin-Expression 52
4.2.3 Transkriptanalyse des Hirudin-Gens in verschiedenen A. chrysogenum
Stämmen 54
4.2.4 Nachweis des aktiven rekombinanten Hirudins in Kulturüberständen
von A. chrysogenum Kotranstormanten 5 6
4.2.5 Immunologische Detektion des rekombinanten Hirudins durch
monoklonale und polyklonale Antikörper 59
4.2.6 Zeitlicher Verlauf der Expression des Hirudin-Gens 61
5. Diskussion 65
5.1 Charakterisierung des pcbC Promotors aus A. chrysogenum: Identifizierung
cis-wirksamer Sequenzbereiche 65
5.1. I Einsatz des lacZ Reportergens zur Promotoranalyse in
A. chrysogenum 66
5.1.2 Integrative Kotransformation der Reportergenvektoren 67
5.1.3 Die sequentielle Deletionsanalyse des pcbC Promotors ermöglicht
die Identifizierung regulatorisch wirksamer Sequenzregionen 69
5.1.4 Ein potentiell positiv cis-wirksamer Sequenzabschnitt des pcbC
Promotors ist an DNA-Protein-Interaktionen beteiligt 73
5.2 Heterologe Genexpression unter Kontrolle des pcbC Promotors 77
5.2.1 Das eukaryontische Polypeptid Hirudin eignet sich als Modellprotein
für die heterologe Genexpression 77
5.2.2 Konstruktion von Expressionskassetten zur Hirudin-Synthese in
A. chrysogenum 78
5.2.3 Das heterologe Hirudin-Gen wird unter der Kontrolle des pcbC
Promotors transkribiert 80
5.2.4 In A. chrysogenum Kotranstormanten ist eine effiziente Synthese und
Sekretion von aktivem Hirudin möglich 81