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Ulrike Müller:

Struktur, Expression und gezielte Inaktivierung von cell, einem vermutlich Cellobiohydrolase-codierenden Gen von Claviceps purpurea

1997. XI, 100 Seiten, 31 Abbildungen, 10 Tabellen, 14x22cm, 250 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 166)

ISBN 978-3-443-59068-0, brosch., price: 41.00 €

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Keywords

HydrolaseClaviceps purpureaMutterkornInfektionGenZelle

Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

Ein vermutlich Cellobiohydrolase-codierendes Gen wurde aus der Lambda-Genbank von Clavicepspurpurea unter Verwendung des Cellobiohydrolase-Gens (cbh1) von Trichoderma reesei als heterologe Sonde isoliert. Die codierende Region des Cel1-Gens umfaßt 1616 bp und enthält zwei Introne. Die abgeleiteten Aminosäuresequenz weist eine mögliche Signalpeptidase-Schnittstelle zwischen der 19. und 20. Aminosäure auf, so daß das reife Protein vermutlich aus 437 Aminosäuren besteht. Die abgeleitete Aminosäuresequenz zeigt signifikante Homologien zu anderen pilzlichen Cellobiohydrolasen, eine bei vielen Cellulasen vorhandene Substratbindungsdomäne fehlt.

Content Description top ↑

Cell wall-degrading enzymes probably play a key role during colonisation of Secale cerale by Claviceps purpurea. Using the cellobiohydrolase I gene (cbh1) of Triclzoderma reesei as a probe, a putative cellulase gene (cel1) was isolated from a genomic library of Claviceps purpurea strain T5. The coding region of 1616 bp contains two introns and a putative signal peptidase cleavage site leaving a coding capacity of 437 amino acids for the mature protein. The derived amino acid sequence shares strong homology with other fungal cellobiohydrolases, but obviously lacks the substrate binding domain.

Inhaltsverzeichnis top ↑

Abbildungsverzeichnis VIII

Tabellenverzeichnis X
Abkürzungsverzeichnis XI
1. Einleitung 1
1.1 Claviceps purpuren 1
1.2 Verlauf der Infektion I
1.3 Enzymatische Hydrolyse von Cellulose 6
1.4 Gezielte Geninaktivierung zur Analyse möglicher
Pathogenitätsfaktoren 8
1.5 Ploidie bei Pilzen 10
2. Material und Methoden 13
2.1 Bakterienstämme und ihre Anzucht 13
2.2 Clariceps purpurea-Stämme und ihre Anzucht 13
2.3 Secale cereale 14
2.4 Plasmide 14
2.5 Primer 15
2.6 Chemikalien 16
2.7 Häufig verluvendete Puffer und Lösungen 17
2.8 Präparation von Nukleinsäuren 18
2.8.1 Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli 18
2.8.2 Isolation von Lambda-DNA 18
2.8.3 Isolation von Gesamt-DNA aus C. purpurea l9
2.8.4 Isolation von Gesamt-RNA aus C. purpurea 20
2.9 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren 20
2.9.1 Gelelektrophorese von DNA 20
2.9.2 Gelelektrophorese von RNA 21
2.10 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 2 1
2.11 Screening der chromosomalen EMBL3-Genbank 21
2.12 Konstruktion rekombinanter DNA (Klonierungen) 21
2.13 Hybridisierungen 22
2.13.1 Markierung von DNA 22
2.13.2 Southern-Blots und DNA-DNA-Hybridisierungen 23
2.13.3 Northern-Blots und DNA-RNA-Hybridisierungen 23
2.14 DNA-Sequenzierung 24
2.15 Benomylbehandlung von C. purpuren zur Erzeugung von Stämmen mit
verändertem DNA-Gehalt 24
2.16 DNA-Gehaltsbestimmungen mit KeruBärbungen 24
2.17 UV-Überlebenskurven 25

2.18 Transformation von C. purpuren 26
2.19 Genetische Reindarstellung der Transtorrnanten 27
2.20 PCR 27
2.20.1 PCR-Reaktion zur Amplifizierung genomischer DNA 27
2.20.2 Transkriptionsnachweis mittels RT-PCR 27
2.21 Plattentests zum Nachweis cellulolytischer Aktivität 28
2.22 Infektion von Secale cerale 28
3. Ergebnisse 29
3.1 Untersuchungen zur Ploidie von Claviceps purpurea 29
3.1.1 Bestimmung der relativen Kern-DNA-Gehalte verschiedener
Benomylisolate von C. purpurea 29
3.1.2 UV-Überlebenskurven 34
3.2 Isolierung eines Cellulase-codierenden Gens von C. purpurea 35
3.2.1 Isolierung einer Cellulase-homologen Region aus einer
genomischen Genbank von C. purpuren 36
3.2.2 Nukleotidsequenz des Cell-Gens und die daraus abgeleitete
Aminosäuresequenz 41
3.2.3 Bestimmung der im Genom von T5 und T5-20.2 vorhandenen
Cell-Kopien 49
3.3 Transkription des Cell-Gens von C. purpurea 50
3.3.1 Transkription des C. purpuren Cell-Gens in axenischer Kultur 50
3.3.2 Transkription des C. purpuren Cell-Gens in infizierten
Roggenfruchtknoten 53
3.4 Erzeugung cell-negativer Transformanten mit Hilfe homologer
Integration 55
3.4.1 Konstruktion des Genausschaltungsvektors pAcellphleoR 55
3.4.2 Transformation von C. purpuren mit pAcellphleoR 56
3.5 Analyse der cell-negativen Transformanten 59
3.5.1 Cellulolytische Aktivität der cell-negativen Transformanten 59
3.5.2 Pathogenitätstests mit cell-negativen Transtormanten auf Secale
cerale 59
3.6 Komplementation eines cell-negativen Transformanten mit dem intakten
Cellulase-Gen 64
3.6.1 Konstruktion des Komplementationsvektors pcel/hygR 64
3.6.2 Transiormation der cell-negativen Transtormante 129 mit pcel/hygR 65
3.6.3 Transkription des Cell-Gens in komplementierten Transformanten 67
4. Diskussion 69
4.1 Ploidie bei C. purpurea 69
4.2 Sequenzanalysen von cell 71
4.2.1 C. purpurea cell im Vergleich zu anderen pilzlichen Cellulasen 71
4.2.2 Fehlende Substratbindungsdomäne 76
4.2.3 Konservierte Intronpositionen 78
4.3 Transkription des Cell-Gens von C. purpurea 79
4.4 Ausschaltung des Cell-Gens mit homologer Integration 84
4.5 Hinweise auf weitere Cellulase-codierenden Gene bei C. purpurea 86
4.6 Mögliche Funktion von C. purpurea cell während der Infektion von
Secale cereale 87
5. Zusammenfassung 91
6. Abstract 92
7. Literatur 93