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Sandra Masloff:

Regulation der Fruchtkörperbildung bei dem Ascomyceten Sordaria macrospora

1998. 142 Seiten, 19 Abbildungen, 10 Tabellen, 14x22cm, 320 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 172)

ISBN 978-3-443-59074-1, brosch., price: 46.00 €

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Keywords

RegulationFruchtkörperAscomycetenHormonPilzfilamentösFortpflanzungregulationfruiting bodyascomyceteshormonefungifilamentousreproduction

Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

In der vorliegenden Arbeit werden Untersuchungen zur Fruchtkörperdifferenzierung an dem filamentösen Ascomyceten Sordaria macrosphora vorgestellt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Entwicklungsgen sdr1 von Sordaria macrosphora isoliert und funktional charakterisiert werden.

Content Description top ↑

In this paper the molecular, genetic and morphological analysis of fruiting body development in the filamentous ascomycete Sordaria macrosphora is presented. In this thesis the developmental gene sdr1 from the ascomycete Sordaria macrosphora was isolated and characterized.

Inhaltsverzeichnnis top ↑

I. Einführung 1
1. Einleitung 1
2. Viele Ascomyceten bilden bei der sexuellen Morphogenese komplexe
multizellulare Strukturen aus 1
3. Die verschiedenen Stadien der Ascokarpdifferenzierung können durch
Mutanten charakterisiert werden 3
4. Die Ascokarpentwicklung ist abhängig vom Zusammenwirken vieler
exogener Faktoren 5
4.1 Licht steuert verschiedene Prozesse der sexuellen Fortpflanzung 5
4.2 Nährstoffmangel kann die sexuelle Fortpflanzung auslösen 6
5. Die Fruchtkörperdifferenzierung unterliegt einer endogenen Kontrolle 7
5.1 Pilzliche Hormone dienen der Zellkommunikation während der
sexuellen Differenzierung 7
5.2 Laccasen sind mögliche Schlüsselenzyme der pilzlichen multizellulären
Entwicklung 9
5.3 Die Kreuzungstyp-Produkte sind an der Regulation der sexuellen
Fortpflanzung beteiligt 10
5.4 In höheren Ascomyceten sind phasenspezifische Proteine nachweisbar 13
5.5 Molekulargenetische Ansätze führten zur Klonierung von Entwicklungsgenen
mit Funktionen in der sexuellen Fortpflanzung 13
6. Zusammenfassung und Ausblick 15
II. Problemstellung 18
III. Material und Methoden 22
I. Material 22
1.1 Stämme 22
1.2 Plasmide und Cosmide 23
1.3 Genbibliothek 24
1.4 Oligonukleotide 24
1.5 Chemikalien 25
1.6 Enzyme 26
1.7 Medien 26
1.8 Häufig verwendete Puffer 2G
2. Methoden 27
2.1 Kulturbedingungen 27
2.2 Formalgenetische Analysen 27
2.3 UV-Mutagenesen 28
2.4 Mikroskopische Analysen 28
2.4.1 Lichtmikroskopie 28
2.4.2 Rasterelektronenmikroskopie 29
2.5 Transformationen 29

2.5.1 Escherichia coli 29
2.5.2 Sordaria macrospora 29
2.6 Isolierung von Nukleinsäuren 30
2.7 Gelelektrophorese 31
2.8 Southern Blots und DNA-DNA-Hybridisierungen 31

2.9 Northern Blots und DNA-RNA-Hybridisierungen 32
2.10 Radioaktive Markierung von DNA 32
2.11 Deletionen mit Exonuklease III Nuklease S1 32
2.12 DNA-Sequenzierung 32
2.13 Oligonukleotidsynthese 33
2.14 Polymerase Kettenreaktion Reaktion (PCR) 33
2.15 Reverse Transkription und Polymerase Ketten Reaktion (RT-PCR) 33
2.16 in vitro-Rekombination von DNA 33
2.17 in vitro-Mutagenese 34
2.18 Auswertung von Nukleotid- und Aminosäuresequenzen 34
2.19 Sicherheitsbestimmungen 34
IV. Ergebnisse 35
1. Durch Mutagenesen können Entwicklungsmutanten von Sordaria
macrospora hergestellt werden 35
1.1 Die Entwicklungsmutanten weisen Störungen in unterschiedlichen Stadien
der Fruchtkörperdifferenzierung auf 35
1.2 Die Entwicklungsmutanten wurden einer formalgenetischen
Analyse unterzogen 39
2. Die pro1-Mutation kann mit Hilfe molekularer Marker kartiert werden 42
2.1 Die DNA-vermittelte Transformation ermöglicht die Herstellung
molekularer Chromosomenmarker 42
2.2 Die pro1-Mutation ist auf Chromosom VI/VII lokalisiert 48
3. Die pro1-Mutation kann mit Klonen einer S. macrospora Cosmid-Bank
komplementiert werden 51
3.1 Der Cosmid-Klon D6 trägt die genetische Information zur
Restaurierung der Fertilität in der pro1-Mutante 51
3.2 In komplementierten pro1-Transformanten kann rekombinante
DNA nachgewiesen werden 55
4. Die molekulare Analyse des komplementierenden DNA-Fragments führt
zur Identifizierung dcs sdr1-Gens 57
4.1 Das komplementierende DNA-Fragment trägt einen offenen
Leserahmen, der für einen putativen Transkriptionsfaktor kodiert 57
4.2 Transkripte des sdr1-Gens sind im Wildstamm nachweisbar,
fehlen jedoch in der pro1-Mutante 62
5. Die Sterilität der pro1-Mutante wird durch eine Deletion verursacht 63
6. Das sdr1-Gen ist an der Kontrolle der Fruchtkörperbildung beteiligt 66
6.1 Ein stromaufwärts vom sdr1-ORF gelegenes 215 bp Fragment
ist für die vollständige Komplementation der pro1-Mutation von
Bedeutung 66
6.2 Eine in vitro-Mutagenese im Bereich der putativen DNA-Bindedomäne
des SDR1-Polypeptids zeigt die Notwendigkeit dieser Region für die
Restaurierung der Fertilität in der pro1-Mutante 70
V. Diskussion 72
1. Mutanten-Analysen erlauben die Charakterisierung der sexuellen
Morphogenese von SorJaria macrospora 72
1.1 Die Mutanten pro1, pro 10 und per5 zeigen Störungen in bislang
noch nicht charakterisierten Stadien der Fruchtkörperdifferenzierung
von S. macrospora 72
1.2 Die verfügbaren Entwicklungsmutanten ermöglichen eine exemplarische
Charakterisierung des komplexen Prozesses der sexuellen
Fortpflanzung 75
1.3 Die Induzierbarkeit der Mutanten pro1 und pro1O liefert Hinweise
auf die mögliche Funktion dieser Loci 77
2. Sordaria macrospora bietet ausgehend von Entwicklungsmutanten
verschiedene Möglichkeiten zur Genisolierung 79
2.1 Die Genkartierung mit Hilfe molekularer Chromosomenmarker stellt eine
Alternative zur RFLP-Kartierung dar 79
2.2 Der pro1-Locus weist eine Kopplung zur Marke R4 auf 81
2.3 Die KomplementationstransLormation mit den Klonen einer
Cosmid-Bank ermöglicht die Isolierung von Entwicklungsgenen in S. macrospora 83
3. Das sdr1-Gen kodiert für ein regulatörisches Protein mit essentiellen
Funktionen in der Fruchtkörperdifferenzierung 85
3.1. Das sdr1 -Gen weist strukturelle Ähnlichkeiten zu bekannten
Kerngenen aus Sordaria macrospora auf 85
3.2 Das sdr1-Gen ist in der pro1-Mutante vollständig deletiert 88
3.3 Das SDRI-Protein enthält im Aminoterminus eine essentielle
Region. die einen Bereich mit Homologien zur Zn(II)2Cys6-DNA-Bindedomäne
pilzlicher Regulatorproteine trägt 88
3.4 Die Struktur des SDRI-Proteins zeigt deutliche Unterschiede
zum typischen Aufbau von C6-Zinkfingerproteinen 94
3.5 Eine Fehlexpression des sdr1-Gens könnte für die Ausbildung
anormal gestalteter Fruchtkörper verantwortlich sein 100
4. Dem putativen Transkriptionsfaktor SDR1 kommt eine mögliche
Funktion als zentraler Regulator der Fruchtkörperdifferenzierung bei
SorHaria macrospora zu 104
VI. Zusammenfassung 108
VII. Summary 11O
VIII. Literatur 112
IX. Anhang 138