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Sabine Giesbert:

Die Xylanasen des phytopathogenen Ascomyceten Claviceps purpurea

Molekularbiologische und funktionale Charakterisierung

1998. 1. Auflage, VIII, 110 Seiten, 14x22cm, 290 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 175)

ISBN 978-3-443-59077-2, brosch., price: 46.00 €

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Keywords

AscomycetenMutterkornPilzGetreideEnzymascomycetesClaviceps purpureafungigrainenzyme

Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

Der vorliegende Band beschreibt die molekularbiologische und funktionale Charakterisierung von Claviceps purpurea. Der phytopathogene, also Pflanzenkrankheiten hervorrufende, Ascomycet Claviceps purpurea ist ein Parasit, der hauptsächlich Getreide wie Roggen, Weizen, Gerste und Hafer sowie Futtergräser befällt. Der Pilz wird im Volksmund "Mutterkorn" genannt.

Content Description top ↑

The present paper describes Claviceps purpurea, a common phytopathogenic fungus colonizing only the florets of cereals and other grasses. The data obtained by now indicate for the first time that xylanases could be essential for the virulence of a phytopathogenic fungus.

Inhaltsverzeichnis top ↑

Danksagung VII

Abkürzungsverzeichnis VII
1 Einleitung 1

1.1 Claviceps purpurea - der Erreger des Mutterkorns 1
1.2 Der Verlauf der Infektion 3
1.3 Charakterisierung zeltwandabbauender Enzyme in der Interaktion
C. purpurea Secale cereale 5

1.3.1 ß-1,3-Glucanase 7
1.3.2 Pektinabbauende Enzyme 7
1.3.3 Cellulasen 8
1.3.4 Xylanasen 8
1.4 Molekulare Genetik Zeltwandabbauender Enzyme 10
1.5 Zielsetzung der Arbeit 13
2 Material und Methoden 14
2.1 Stämme und Kulturbedingungen 14
2.2 Plasmide 15
2.3 Primer 15
2.4 Antikörper 16
2.5 Chemikalien 16
2.6 Häufig verwendete Puffer und Lösungen 17
2.7 Molekularbiologische Arbeitsmethoden 18
2.7.1 Präparation von Nukleinsäuren 18
2.7.1.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli 18
2.7.1.2 Isolierung von Lambda-DNA 18
2.7.1.3 Isolierlmg von Gesamt-DNA aus C purpurea 18
2.7.1.4 Isolierung von Gesamt-RNA aus C. purpurea 18
2.7.2 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren 19
2.7.2.1 Gelelektrophorese von DNA 19
2.7.2.2 Gelelektrophorese von RNA 19
2.7.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 19
2.7.4 Transfer von Nukleinsäuren auf Membranen 19
2.7.4.1 Transfer von DNA auf Membranen 19
2.7.4.2 Transfer von RNA auf Membranen 19
2.7.5 Screening der chromosomalen EMBL3-Genbank von C purpurea 19
2.7.6 Hybridisierungen 20
2.7.6.1 Markierung von DNA 20
2.7.6.2 DNA-DNA-Hybridisierung 20
2.7.6.3 RNA-DNA-Hybridisierung 20
2.7.7 Klonierung von DNA-Fragmenten 21
2.7.8 DNA-Sequenzierung 22
2.7.9 Transformation von C. purpurea 22
2.7.10 PCR 23
2.7.10.1 Amplifikation spezifischer Fragmente der genomischen DNA 23
2.7.10.2 RT-PCR 23
2.8 Pathogenitätstests 24
2.9 Proteinchemische Arbeitsmethoden 24
2.9.1 Gewinnung extrazellulärer Proteine 24
2.9.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 25
2.9.3 Bestimmung der Enzymaktivität 25
2.9.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 26
2.9.5 Western-Blot nach Polyacrylamid-Gelelektrophorese 26
2.9.6 Immumologische Blotfärbung 27
3 Ergebnisse 29
3.1 Isolierung und Charakterisierung des Xylanase-codierenden Gens xyl1 von
C. purpurea 29

3.1.1 Sequenzierung 32
3.1.2 Struktur 34

3.1.3 Klassifizierung 37
3.1.4 Bestimmumg der Kopiezahl 39
3.2 Untersuchumg der Transkription von xyl1 in planta 40
3.3 Inaktivierung von xyl1 42
3.3.1 Konstruktion eines "gene-replacement"-Vektors 42
3.3.2 Transformation von C. purpurea zur Herstellumg einer
xyl1-negativen Mutante 43

3.4 Biochemische Analyse der Axyl1-Mutante 44
3.4.1 Xylanaseaktivität 44
3.4.2 Immunfärbung mit heterologen Antikörpern 45
3.5 Isolierung und Charakterisierung von xyl1 47
3.5.1 Sequenzierung 49
3.5.2 Struktur 50
3.5.3 Klassifizienmg 54
3.5.4 Kopiezahlbestimmung 56
3.6 Untersuchung der Transkription von xyl2 in planta 57
3.7 Inaktivienmg von xyl2 59
3.7.1 Konstruktion eines "gene-replacement"-Vektors 59
3.7.2 Transformation zur Herstellumg einer xyl2-negativen Mutante 60
3.8 Xylanaseaktivität der Stämme Axyl1 und xyl2 62
3.9 Untersuchungen zur Auswirkung der Ausschaltung von xyl1 und xyl2 auf die
Pathogenität von C. purpurea 63
3.10 Herstellumg einer Axyl1/Axyl2-Doppelmutante 70
4 Diskussion 72
4.1 Sequenz-Analyse der Xylanase-codierenden Gene von C purpurea 72
4.1.1 Promotorregion 72
Mögliche Bindestellen für Regulatorproteine 73
4.1.2 Strukturgen 76

4 2 xyl1 und xyl2: Mitglieder zweier unterschiedlicher Xylanase-Familien 80
4.3 Sekretion verschiedener Xylanasen von C. purpurea 82
4.4 Regulation der Xylanaseaktivität 84
4.5 Untersuchungen zur Pathogenität der Xylanase-Mutanten 89
4.5.1 Pathogenitätstests 89
4.5.2 Mögliche Funktion der Xylanasen bei der Infektion 91
4.5.3 Ausblick 97
5 Zusammenfassung 98
6 Summary 99
7 Literatur 100