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Claudia Arntz:

Molekularbiologische Untersuchungen zur Alkaloidsynthese bei Claviceps

[A study of the molecular biology of alcaloid production in Claviceps]

1999. VI, 145 Seiten, 45 Abbildungen, 4 Tabellen, 14x22cm, 350 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 176)

ISBN 978-3-443-59078-9, brosch., price: 46.00 €

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Keywords

MykologieAlkaloidmolekularBiologieAscomycetenClavicepsmycologyalcaloidmolecularbiologyascomycetes

Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

Die zur Klasse der Ascomyceten gehörende Gattung Claviceps beinhaltet mehrere Arten, die als Parasiten auf verschiedenen Getreiden und Gräsern zu finden sind. Typische Sekundärmetaboliten der Claviceps-Arten sind die Alkaloide. Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchung zur Alkaloidsynthese von Claviceps sind Thema dieses Bandes.

Inhaltsverzeichnis top ↑

Abkürzungsverzeichnis VI

1. Einleitung 1

1.1 Die Gattung Claviceps 1
1.2 Claviceps als Alkaloidproduzent 1
1.2.1 Struktur und Biosynthese 1

1.2.2 Eigenschaften 8

1.2.3 Alkaloide in der Industrie 11
1.2.4 Regulation und Physiologie der Biosynthese 13

1.3 Hydrophobine 18

1.4 Zielsetzung der Arbeit 24

2. Material und Methoden 25

2.1 Bakterienstämme und ihre Anzucht 25

2.2 Claviceps-Stämme und ihre Anzucht 25

2.3 Nukleinsäuren 27

2.4 Chemikalien, Enzyme und Kits 28

2.5 Häufig verwendete Puffer und Lösungen 29

2.6 Präparation von Nukleinsäuren 30

2.6.1 Isolation von Plasmid-DNA aus E.coli 30

2.6.2 Isolation von Lambda-DNA 31

2.6.3 Isolation von pilzlicher Gesamt-DNA 31

2.6.4 Isolation von pilzlicher Gesamt-RNA 32

2.6.5 Isolation von pilzlicher mRNA 33

2.7 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren 33

2.7.1 Gelelektrophorese von DNA 33

2.7.2 Gelelektrophorese von RNA 33

2.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 33

2.9 Klonierung von DNA-Fragmenten 33
2.10 Transfer von Nukleinsäuren auf Membranen 34

2.10.1 Transfer von DNA auf Membranen 34

2.10.2 Transfer von RNA auf Membranen 34

2.11 Hybridisierungen 35

2.11.1 Markierung von DNA 35

2.11.2 DNA-DNA Hybridisierung 35
2.11.3 RNA-DNA-Hybridisierung 35

2.12 Erstellung einer cDNA-Bank 36
2.13 Differentielles cDNA-Bank-Screening 36
2.14 Erstellung einer genomischen Bank 38

2.15 Screening der chromosomalen EMBL3-Genbank von C. purpurea 38

2.16 DNA-Sequenzierung 39
2.17 PCR 39
2.18 Differential Display 40

2.19 Alkaloidbestimmung 41
3. Ergebnisse 42

3.1 Ansätze zur Identifizierung von Genen, die unter Alkaloidsynthese-
Bedingungen induziert sind 42

3.1.1 Differential Display 42

3.1.2 PCR mit Prenyltransferase-Primern 43
3.1.3 Differentielles cDNA-Bank Screening

3.1.3.1 Erstellung einer cDNA-Bank 44

3.1.3.1.1 Kultivierung des Pilzes und RNA-lsolation 44
3.1.3.1.2 Erstellung und Analyse der cDNA-Bank 45

3.1.3.2 Differentielle Analyse der cDNA-Bank 46

3.1.3.3 Sequenzierung der cDNA-Fragmente 48

3.1.3.3.1 DMATS-Gen 48

3.1.3.3.2 Streß-Gen 49

3.1.3.3.3 Hydrophobin-Gen 50

3.2 Gründe für den Wechsel des untersuchten Claviceps-Stammes 52

3.3 Isolation und Charakterisierung der unter Alkaloidsynthese-Bedingungen
induzierten Gene 56

3.3.1 Isolation der genomischen Kopien 56
3.3.1.1 DMATS 56
3.3.1.1.1 Isolation, Klonierung und Sequenzierung eines
genomischen DMATS-Klons aus C. purpurea T5 56
3.3.1.1.2 Isolation, Klonierung und Sequenzierung eines genomischen Klons aus
C. purpurea 1029/N5 64

3.3.1.2 Trihydrophobin 70

3.3.2 Kopiezahlbestimmung der isolierten Gene 72
3.3.2.1 DMATS 72

3.3.2.2 ccg-1-homologes Gen 74
3.3.2.3 Trihydrophobin-Gen 75
3.3.3 Einfluß von Phosphat auf die Expression des Trihydrophobin- und
des DMATS-Gens von C. purpurea 1029/N5 75
3.3.3.1 Trihydrophobin 76
3.3.3.2 DMATS 78

3.4 Nachbarschaftsanalysen bei den DMATS-Genen 80

4 Diskussion 83
4.1 Sequenz- und Regulationsanalysen 84
4.1.1 Trihydrophobin 84
4.1.2 DMATS 92
4.2 Die stille Kopie der DMATS bei C. purpurea 1029/N5 101
4.3 Nachbarschaftsanalyse der DMATS-Gene 108
4.4 Die isolierten Gene im Kontext der Differenzierung 114
5 Zusammenfassung 123
6 Literaturverzeichnis 124
7 Anhang 141
Danksagung