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Minou Nowrousian:

Zelldifferenzierung während der sexuellen Entwicklung des Asomyceten Sordaria macrospora

[Differentiation of cells of Sordaria macrospora (Ascomycetes) during its sexual maturation]

1999. 1. Auflage, 119 Seiten, 28 Abbildungen, 14x22cm, 280 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 179)

ISBN 978-3-443-59081-9, brosch., price: 41.00 €

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Keywords

MykologieFortpflanzunggeschlechtlichgeschlechtslosZelleAscomycetenEntwicklungmycologyreproductionsexualasexualcellascomycetesdevelopment

Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

In den Kapiteln des vorliegenden Bandes werden ausgewählte Ergebnisse molekularbiologischer Analysen über den hyphenähnlichen Wuchs von hefeartigen Pilzen und über die Differenzierung sporenbildender Strukturen bei Hyphenpilzen dargestellt. Die Regulation einiger Differenzierungsvorgänge ist bereits intensiv untersucht worden.

Inhaltsverzeichnis top ↑


I. Einführung 1
1. Einleitung 1
2. Hyphenwuchs bei hefeartigen Pilzen 2
2.1 Der Pseudohyphenwuchs bei Saccharomyces cerevisiae als Modell
für den Übergang zu polarisiertem Wachstum 2
2.2 Hyphenwuchs und Pathogenität sind bei Ustilago maydis korreliert 6
3. Strukturen zur asexuellen Fortpflanzung bei Hyphenpilzen 8
3.1 Die Differenzierung von asexuellen Sporen bei Aspergillus nidulans
wird durch räumliche und zeitliche Muster der Expression
verschiedener Transkriptionsfaktoren reguliert 8
3.2 Eine innere Uhr reguliert die Konidienbildung bei Neurospora crassa 11
4. Die Kreuzungstypgene der Ascomyceten kodieren für Transkriptionsfaktoren,
die für die Regulation der Dikaryophase entscheidend sind 13
5. Einige Zielgene entwicklungsgesteuerter Regulationsprozesse kodieren
für Zellwandproteine 17
6. Die Erforschung der Zelldifferenzierung bei Pilzen liefert interessante
Einblicke in verschiedenste Regulationsprozesse 18

II. Problemstellung 20

III. Material und Methoden 24

1. Material 24
1.1 Stämme 24
1.2 Plasmide 24
1.3 Oligonukleotide 26
1.4 Genbibliothek 27
1.5 Chemikalien 27
1.6 Enzyme 27
1.7 Häufig verwendete Puffer 28
1.8 Nährmedien 28
2. Methoden 28
2.1 Kulturbedingungen 28
2.2 Isolierung von Nukleinsäuren 29
2.2.1 Plasmid- und Cosmid-DNA aus Escherichia coli 29
2.2.2 Gesamt-DNA aus Pilzen 29
2.2.3 Gesamt-RNA aus Sordaria macrospora 29
2.3 Protoplastierung von Sordaria macrospora 29
2.4 Tansformationen 30
2.4.1 Transformation von Escherichia coli 30
2.4.2 Transformation von Sordaria macrospora 30
2.5 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA und RNA 30
2.6 Elution von DNA aus Agarosegelen 31
2.7 In vitro-Rekombination von DNA 31
2.8 Radioaktive Markierung von Nukleinsäuren 31
2.9 Blotverfahren und Hybridisierungen 31
2.10 Oligonukleotidsynthese 32
2.11 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 32
2.11.1 PCR von S. macrospora-Gesamt-DNA 32
2.11.2 RT-PCR 32
2.12 DNA-Sequenzierung 33
2.13 Auswertung von Nukleotid-Sequenzen 33
2.14 «Primer extension» 33
2.15 Herstellung von Proteinrohextrakten aus Pilzmyzel 34
2.16 Nachweis von Enzymaktivitäten 34
2.16.1 Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Test 34
2.16.2 Malat-Dehydrogenase-gekoppelter ATP-Citrat-Lyase-Test 34

2.16.3 Chloramphenicol-Acetyl-Transferase-gekoppelter ATP-Citrat-Lyase-Test 36

2.17 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western-Blot 36
2.18 Immunhistochemie 37
2.19 Fluoreszenzmikroskopie 38
2.20 Rasterelektronenmikroskopie 38
2.21 Sicherheitsmaßnahmen 38
IV. Ergebnisse 39
1. Morphologische und cytologische Charakterisierung der Mutante per5 39
2. Komplementation der Mutante per5 mit einer S. macrospora-Cosmid-Genbank 41
3. Analyse des acll-Gens und seiner Expression in der Mutante per5 48
3.1 Genetische und molekulare Analyase des acll-Allels der Mutante per5 48
3.2 Transformation der Mutante per5 mit mutierten und deletierten
Derivaten des komplementierenden Cosmid-Klons 50
3.3 Vergleich der acll-Transkription zwischen S. macrospora-Wildtyp
und Mutante per5 53
3.4 Untersuchung der ACL-Aktivität in Wildtyp, Mutante und
komplamentierten Transformanten 54
3.5 Teilkomplementation der Mutante per5 durch verschiedene
Medien-Zusätze 57
4. Untersuchung des ACL1-Polypeptids 58
4.1 "Epitope tagging" des ACL1-Polypeptids 59
4.2 Subzelluläre Lokalisation des ACL1-Polypeptids in Hyphen
von S. macrospora 62
5. Entwicklungsabhängige Regulation der acll-Expression in S. macrospora 63
5.1 Analyse der ACL-Aktivität im Verlauf der Entwicklung
von S. macrospora 63
5.2 Analyse der acll-Transkriptmenge sowie des ACL-Polypeptids
im Verlauf der Entwicklung von S. macrospora 66

6. Einfluß des sdr-Gens auf die ACL-Aktivität in S. macrospora 68

7. Entwicklungsabhängige Regulation der ACL-Aktivität bei
Podospora anserina und Aspergillus nidulans 69

V. Diskussion 74

1. Das Gen für die ATP-Citrat-Lyase komplementiert die Entwicklungsmutante
per5 von Sordaria macrospora 74

2. Eukaryotische ATP-Citrat-Lyase-Gene sind sehr konserviert 76

2.1 Das acll-Gen von S. macrospora weist hohe Homologien zu den
ATP-Citrat-Lyase-Genen anderer Eukaryoten auf 76

2.2 Das ACLI-Polypeptid von S. macrospora ist kleiner als das
ACL-Polypeptid aus Tieren 79

2.3 Subzelluläre Lokalisation und physiologische Funktion
der ATP-Citrat-Lyase 81

3. ATP-Citrat-Lyase-Aktivität ist für die Fruchtkörperentwicklung
von S. macrospora erforderlich 85

3.1 Die Mutante per5 leidet unter Acetyl-CoA-Mangel 85

3.2 Für eine erfolgreiche sexuelle Entwicklung sind bei vielen
Pilzen bestimmte Lipide erforderlich 87

3.3 Die Bereitstellung von Basismetaboliten ist entwicklungs-
abhängig reguliert 89

3.4 Modellvorstellung zur Funktion der ATP-Citrat-Lyase in der

Fruchtkörperentwicklung von S. macrospora 93

VI. Zusammenfassung 96

VII. Summary 99

VIII. Literatur 102

IX.Anhang 117