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Esther Schmitt:

Der Transkriptionsfaktor CPCR1, ein Regulator der Cephalosporin-C Biosynthese in Acremonium chrysogenum

[The CPCR1 transcription factor, a regulator of the biosynthetic production of cephalosporin-C in Acremonium chrysogenum]

1999. 1. Auflage, 119 Seiten, 22 Abbildungen, 6 Tabellen, 14x22cm, 260 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 181)

ISBN 978-3-443-59083-3, brosch., price: 41.00 €

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Keywords

MykologieAcremonium chrysogenumTranskriptionsfaktorCPCR1Regulator

Contents

Synopsis top ↑

This work presents the isolation and characterisation of a transcription factor from the ?-lactam producing filamentous fungus Acremonium chrysogenum. Using the yeast one-hybrid system, the cDNA of a regulatory protein with specific for the promoter of a cephalosporin C biosynthesis gene was identified. Sequence analysis of the isolated cDNA and the corresponding genomic DNA led to the identification of an open reading frame, which contains 830 amino acids. The gene was named cpcR1 for cephalosporin C regulator 1 and shares homologies with a family of DNA-binding proteins called RFX. The protein CPCR1 binds in vitro and in vivo to an imperfect palindromic sequence in the pcbC promoter. Two-hybrid experiments revealed that CPCR1 interacts with itself and forms a homodimer.

Inhaltsbeschreibung top ↑

In der vorliegenden Arbeit wird die Isolierung und Charakterisierung eines Transkriptionsfaktors aus dem ß-Lactam-Produzenten Acremonium chrysogenum beschrieben. Zur Identifizierung eines regulatorischen Proteins mit Spezifität für den Promotor eines Cephalosporin C-Biosynthesegens wurde das Hefe ONE-HYBRID-System verwendet. In dieser Arbeit wurde erstmals ein Transkriptionsfaktor aus dem Cephalosporin C-Produzenten Acremonium chrysogenum isoliert und funktionell charakterisiert. Damit konnte das Hefe ONE-HYBRID-System erfolgreich auf einen biotechnologisch relevanten Hyphenpilz angewandt werden.

Inhaltsverzeichnis top ↑

I. Einführung 1
1. Einleitung 1
2. Transkriptionsfaktoren bei Hyphenpilzen: Eine Übersicht 3
2.1 Die Modellorganismen Neurospora crassa und Aspergillus nidulans 5

2.2 Pathogene Hyphenpilze 7

3. Wie steuern die homologen Transkriptionsfaktoren NIT2 und AREA die
Expression von über 100 Zielgenen? 8
3.1 Aufbau des Transkriptionsfaktors AREA 9
3.2 Spezifität der DNA-Bindung 9
3.3 Molekulare Regulation der Stickstoffassimilation 10
4. pH-abhängige Transkription durch den Transkriptionsfaktor PacC 11
4.1 PacC ist Aktivator und Repressor 12
4.2 PacC bindet an Promotoren von Genen der Penicillin-Biosynthese 14
5. Die Regulation der Aflatoxin- und Sterigmatocystin-Biosynthese durch den
regulatorischen Faktor AflR 15
5.1 Aflatoxin- und Sterigmatocystin-Biosynthesogene 15
5.2 Charakterisierung des Aktivators AflR 16
6. Zusammenfassung und Ausblick 18
II. Problemstellung 19
III. Material und Methoden 22
1. Material 22
1.1 Stämme 22
1.2 Genbibliotheken 22
1.3 Plasmide 23
1.4 0ligonukleotide 24
1.5 Nährmedien 25
1.6 Häufig verwendete Puffer 25
1.7 Chemikalien 26
1.8 Enzyme 26
2. Methoden 27
2.1 Kulturbedingungen 27

2.2 Transformationen 27
2.3 Isolierung von Nukleinsäuren 27
2.4 Isolierung von Proteinen 28
2.4.1 Herstellung von Gesamtproteinextrakten aus Saccharomyces cerevisinae und
Acremonium chrysogenum 28
2.4.2 Anreicherung von DNA-Bindeproteinen mittels Chromatographie 29
2.4.3 Bestimmung der Proteinkonzentration 30
2.5 Gelelektrophorese 30
2.6 Southern Blots und DNA-DNA-Hybridisierungen 30
2.7 Northern Blots und DNA-RNA-Hybridisierungen 31
2.8 Radioaktive Markierung von DNA 31
2.9 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 31
2.10 DNA-Sequenzierung 31
2.11 Oligonukleotidsynthese 32
2.12 In vitro Rekombination von DNA 32
2.13 cDNA-Synthese und Erstellung einer cDNA-Plasmidbank 32
2.14 Nachweis der ß-Galaktosidase-Aktivität von Hefetransformanten 33
2.15 Analyse von DNA-Protein-Interaktionen mit dem
ONE-HYBRID-System 34
2.16 Analyse von Protein-Protein-Interaktionen mit dem
TWO-HYBRID-System 34
2.17 Analyse von DNA-Protein-Interaktionen durch Gelretentionstests 35
2.18 DNaseI-"footprinting" Experimente 35
2.19 Auswertung von Nukleotidsequenzen 35
2.20 Sicherheitsbestimmungen 35
IV. Ergebnisse 36
1. Isolierung eines Transkriptionsfaktors von Acremonium chrysogenum unter
Verwendung des ONE-HYBRID-Systems 36

1.1 Anlegen einer cDNA-Bank von A. chrysogenum und Konstruktion von
Hefe-Reportergenstämmen 37
1.2 Identifizierung eines putativen Transkriptionsfaktors mit Spezifität für
die Bindestelle 39
1.3 Sequenzanalyse von cDNA und zugehöriger genomischer DNA, die
für einen Transkriptionsfaktor kodieren 42
2. In vivo und in vitro Analysen des CPCR1-Proteins von A. chrysogenum 48
2.1 Nachweis einer spezifischen Bindung des CPCR1-Proteins an eine
palindromische Sequenz des pcbC-Promotors 49

2.1.1 In vivo Analysen des CPCR1 -Proteins mit mutierten
Bindestellen 49
2.1.2 In vitro Gelretentionsanalysen 52
2.1.3 In vitro DNaseI-"footprinting" Experimente 55
2.2 Charakterisierung der Dimerisationsdomäne des CPCRl-Proteins

2.2.1 ONE-HYBRID Experimente zur in vivo DNA-Bindeaktivität 58
2.2.2 TWO-HYBRID Experimente zur Bestimmung von Protein-Protein-Interaktionen
59
3. Molekulare Charakterisierung des cpcR1-Gens von A. chrysogenum 62
3.1 Southern-Analyse von drei verschiedenen Acremonium-Stämmen 62
3.2 Transkriptanalysen 63
V. Diskussion 67
1. Das ONE-HYBRID-System ist zur Isolierung sequenzspezifischer
Transkriptionsfaktoren aus Acremonium chrysogenum geeignet 67
1.1 Herkömmliche Methoden zur Isolierung DNA-bindender Proteine aus
Hyphenpilzen können in A. chrysogenum nicht angewandt werden 68
1.2 Das ONE-HYBRID-System wurde zur Klonierung eines
Transkriptionsfaktors aus A. chrysogenum erfolgreich eingesetzt 70
2. Das CPCR1-Protein ist ein typisches Mitglied der Familie der RFX-
Transkriptionsfakoren 75
3. Das CPCR1-Protein bindet spezifisch an eine Sequenz aus dem
pcbC-Promotor 80
3.1 Die Bindestelle enthält ein imperfektes Palindrom 81
3.2 Das CPCR1-Protein bindet als Homodimer 84
3.3. Hat die Sequenz 5'-CCAAT-3' in der Bindestelle des CPCR1-
Proteins eine funktionelleBedeutung als CCAAT-Box? 87
4. Wie reguliert der Transkriptionsfaktor CPCR1 die Expression von
Cephalosporin C-Biosynthesegenen? 91
VI. Zusammenfassung 98
VII. Summary 100
VIII. Literatur 102
IX. Anhang 119