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Sabine Jacobsen:

Verbreitung und Aktivität des Transposons Restless in biotechnologisch relevanten Hyphenpilzen

1999. 1. Auflage, 126 Seiten, 21 Abbildungen, 9 Tabellen, 14x22cm, 280 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 182)

ISBN 978-3-443-59084-0, brosch., price: 46.00 €

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Keywords

MykologiePilzTransposonMutageneseAktivitätRestlessmycologyfungitransposonmutagenesis

Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, die Verbreitung des Transposons Restless in einer Gruppe verwandter Hyphenpilze zu untersuchen und die Eignung des Elements zur Transposon-Mutagenese zu überprüfen. Um die Verwandtschaftsbeziehungen der Stämme untereinander zu analysieren, wurde zusätzlich eine molekulare Charakterisierung dieser Pilzstämme durchgeführt.

Inhaltsverzeichnis top ↑

I. Einführung 1

1. Einleitung 1
2. Transposonen in Hyphenpilzen 3
2.1 Klasse 1 -Elemente 4
2.2 Klasse 2-Elemente 5
2.2.1 Tc1/mariner-Elemente 5
2.2.2 Fot1/pogo-Elemente 6
2.2.3 hAT-Elemente 7
2.2.4 MITE-Elemente 8
3. Einfluß von Transposonen auf die Struktur und Variabilität von
Hyphenpilzgenomen 8
3.1 Sequenzveränderungen nach Exzisionen von DNA-Transposonen 9
3.2 Insertion von Transposonen in Telomer- und Centromerregionen 11
4. "RIP" und "MIP": Mechanismen zur Inaktivierung von Transposonen? 12

5. Anwendung von Transposonen als spezifische Markersequenzen 15
6. Zusammenfassung und Ausblick 16
II. Problemstellung 19
III. Material und Methoden 23
1. Material 23
1.1 Stämme 23
1.2 Plasmide 24
1.3 Oligonukleotide 24
1.4 Chemikalien 25
1.5 Enzyme 25

1.6 Nährmedien 26
1.7 Häufig verwendete Puffer 26
2. Methoden 27
2.1 Kulturbedingungen 27
2.2 Isolierung von Nukleinsäuren 27
2.3 DNA-Transformationen 28
2.4 Selektion putativer Exzisonsereignisse in
T. inflatum-Transformanten 29
2.5 Gelelektrophorese 29
2.6 Southern-Blots und DNA/DNA-Hybridisierungen 29
2.7 Radioaktive Markierung von DNA 30
2.8 DNA-Sequenzierung 30
2.9 Oligonukleotid-Synthese 30
2.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 30
2.10.1 Standard-PCR-Reaktionen 30
2.10.2 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-PCR-Reaktionen 31
2.10.3 Inverse PCR-Reaktionen 31
2.10.4 Asymmetrische PCR-Reaktionen 31
2.11 Auswertung von Nukleotid- und Aminosäuresequenzen 32
2.12 Sicherheitsbestimmungen 32
IV. Ergebnisse 33
1. Molekulare Charakterisierung der untersuchten Stämme 33
1.1 RAPD-Analysen zur Unterscheidung morphologisch einheitlicher Stämme 33
1.2 Sequenzvergleiche zur phylogenetischen Analyse der verschiedenen Stämme 36
1.2.1 Sequenzanalyse des Alpha-Tubulin-Gens 36
1.2.2 Sequenzanalyse der ITS (internal transcribed spacer)-Bereiche
der rDNA 39
2. Verbreitung des Restless-Transposons 44
2.1 Southern-Hybridisierungen mit Restless-spezifischen Sonden 44
2.2 Analyse der unvollständigen Kopie Restless-d1 im Stamm
B. nivea ATCC 42437 50
2.3 Analyse der das Restless-d1-Element flankierenden
DNA-Sequenzen 55
3. Versuche zur Etablierung eines "Transposon Tagging"-Systems
mit dem Restless-Element 60
3.1 Herstellung transgener Pilzstämme zur Analyse der Aktivität
der Restless-Kopie in dem Vektor pFW128 60
3.2 Phänotypische Detektion putativer Exzisionsereignisse durch
Selektion auf Phleomycinresistenz bei ausgewählten T. inflatum-
Transformanten 63
3.3 Molekulare Analyse Phleomycin-resistenter Sporenisolate 67
3.3.1 Nachweis veränderter Hybridisierungsmuster nach
putativen Exzisionsereignissen 67
3.3.2 Nachweis von Exzisionsereignissen durch PCR und
Sequenzanalyse der Exzisionsorte 70
V. Diskussion 73
1. Die untersuchten Pilzstämme der Gattungen Tolypocladium und
Beauveria stellen eine sehr eng verwandte Gruppe dar 73
1.1 Die RAPD-PCR ermöglicht eine Unterscheidung der bei
Sequenzanalysen nahezu identischen T inflatum-Gruppe 74
1.2 Anhand von Intronsequenzen aus dem Alpha-Tubulin-Gen kann
die T. inflatum-Gruppe von anderen Tolypocladium-Arten
abgegrenzt werden 75
1.3 Die Sequenzanalysen der ITS-Bereiche der rDNA bestätigen
die taxonomische Einordnung der T.inflatum-Gruppe in die
Gattung Tolypocladium 78
1.4 Das Restless-Transposon weist innerhalb der T.inflatum-
Gruppe eine diskontinuierliche Verbreitung auf 81
2. Zwei Pilzstämme besitzen Restless-Kopien mit Deletionen des
5`-Bereichs 84
2.1 Das 5`-deletierte Element Restless-d1 weist eine hohe
Sequenzdivergenz im Vergleich zu intakten Restless-Kopien auf 86
2.2 Die flankierenden Sequenzen am Insertionsort des Restless-d1 -
Transposons weisen charakteristische Kennzeichen pilzlicher), hAT-
Elemente auf 89
2.3 Der Insertionsort des Elements Restless-d1 entspricht einer
komplexen Anordnung ineinander-inserierter hAT-Elemente 91
3. Die kloniert vorliegende Restless-Kopie weist in T. inflatum-Stämmen
Transpositionsaktivität auf 94
3.1 Der Vektor pFW128 ermöglicht die phänaotypische Detektion
von Exzisionsereignissen des Restless-Transposons 94
3.2 Putative Reinsertionen der exzisierten Restless-Kopien konnten
im Stamm Ti2 detektiert werden 97
3.3 Die Exzisionsraten in den Rezipientenstämmen Ti1, Ti2 und Ti3
zeigen vermutlich keine signifikanten Unterschiede 98
3.4 Exzisionen der klonierten Restless-Kopie sind relativ selten 99
3.5 Die Exzision des Restless-Transposons aus der Plasmidsequenz
des Vektors pFW128 erzeugt zwei verschiedene "footprint"-
Sequenzmuster 100
VI. Zusammenfassung 106
VII. Literatur 109
VIII. Anhang 124