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Kerstin Jekosch:

Glukoseregulation der Cephalosporin C-Biosynthese im Hyphenpilz Acremonium chrysogenum

[Regulation of the biosynthesis of cephalosporin C by glucose in different strains of the filamentous fungus Acremonium chrysogenum]

1999. 144 Seiten, 31 Abbildungen, 8 Tabellen, Anhang, 14x22cm, 350 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 183)

ISBN 978-3-443-59085-7, brosch., price: 46.00 €

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Keywords

Mykologie Hyphenpilz Acremonium chrysogenum Cephalosporin C-Biosynthese Glukose

Contents

Summary top ↑

The 13-lactam antibiotic cephalosporin C is of great importance in pharmaceutical applications. The present work includes the first investigation of the cephalosporin C biosynthesis regulation by glucose on the molecular level in different strains of the filamentous fungus Acremonium chrysogenum. Hereby, interest has been focussed on the effect of glucose on the expression of the biosynthesis genes pcbC, cefEF and cefG. Furthermore, the transcription factor CREA from A. chrysogenum has been isolated and its involvement in cephalosporin C biosynthesis regulation by glucose has been analyzed. The following results can be summarized:

1) Northern analysis of pcbC transcript levels showed that this gene is subject to a strain-specific transcriptional regulation by glucose. This regulation takes place in the wild-type ATCC 14553, but not in the semi-producers A3/2 and Act. By raising specific antibodies against the pcbC gene product and subsequent western analysis, it could be shown that no additional regulation at the translational level is present.

2) By northern analysis of transcript levels, it was demonstrated that the cefEF gene is transcriptionally repressed by glucose in all strains tested. A glucose effect does not occur at the post-trancriptional level, as was shown by mRNA stability analysis. Western analysis ruled out further regulation at the translational level.

3) Regarding the expression of cefG, no glucose dependent regulation was observed at the transcriptional level. Western analysis, performed after previously raising specific antibodies, showed that there is no regulation on translational level, either. Quantification of produced B-lactam antibiotics did not suggest any effect on the post-translational level. Therefore, cefG is the only gene in the cephalosporin C biosynthesis not being regulated by glucose.

4) In many filamentous fungi, the transcriptional glucose repression is mediated by transcription factors of the CREA/CRE1 family. In the present work, the creA gene from A. chrysogenum was isolated from a gene-library. The gene product CREA is conserved in all functional domains and shows extended homology to CRE1 from Trichoderma reesei. In addition, there is a positive regulation of the creA transcription in presence of glucose, which suggests an auto-regulation and a yet unknown activator function.

5) By transforming A. chrysogenum A3/2 with additional copies of the creA gene, a wild-type-like transcriptional repression of the previously derepressed pcbC gene could be achieved. Simultaneously, the transcriptional repression of cefEF was increased. These findings suggest an involvement of CREA in the glucose regulation of these genes. A model of CREA function is given. The results of this work prove that glucose is an important factor in the negative regulation of the cephalosporin C biosynthesis in A. chrysogenum. So far, CREA is the first transcription factor in A. chrysogenum which has been identified as being involved in regulatory processes in this fungus. The investigation of nutrient-dependent and strain-specific regulatory mechanisms may serve to optimize the industrial cultivation and the targeted strain improvement by genetic engendering.

Zusammenfassung top ↑

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Glukoseregulation der pharmazeutisch relevanten Cephalosporin C-Biosynthese in verschiedenen Stammen des Imperfekten Hyphenpilzes A. chrysogenum auf molekularer Ebene analysiert. Hierbei stand die Beeinflussung der Expression der Biosynthesegene pcbC, cefEF und cefG im Mittelpunkt des Interesses. Zusätzlich wurde der Transkriptionsfaktor CREA aus A. chrysogenum isoliert und seine Beteiligung an der Glukoseregulation untersucht. Zusammenfassend wurden folgende Ergebnisse erhalten:

1) Northern-Analysen der Transkriptmengen des pcbC-Gens zeigten, daß dieses Gen einer stammspezifischen transkripttonalen Regulation durch Glukose unterliegt, die im Wildtyp ATCC 14553, nicht aber in den Semiproduzenten A3/2 und Act zu beobachten ist. Durch Herstellung eines spezifischen Antiserums und Western-Analysen konnte gezeigt werden, daß keine zusätzliche Regulation auf transtattonaler Ebene vorliegt.

2) Durch Northern-Analysen der Transkriptmengen des ceEF-Gens konnte nachgewiesen werden, daß dieses Gen in allen drei untersuchten Stämmen transkripttonal durch Glukose reprimiert ist. Untersuchungen der Transkriptstabilitäten in Abhängigkeit von Glukose zeigten, daß ein posttranskriptionaler Effekt nicht vorhanden ist. Durch Western-Analysen konnte eine zusätzliche Glukoseregulation auf transtattonaler Ebene ausgeschlossen werden.

3) Beim cefG-Gen war keine glukosebedingte Regulation auf transkripttonaler Ebene zu beobachten. Nach Herstellung eines spezifischen Antiserums und Western-Analysen zeigte sich, daß auch auf transtattonaler Ebene kein Einfluß vorhanden ist. Die Untersuchungen der produzierten Mengen an ß-Lactam-Antibiotika ließen ebenfalls keinen Einfluß auf das Genprodukt von cefG auf posttranstattonaler Ebene vermuten. Das cefG-Gen stellt somit das bisher einzige Gen innerhalb des Cephalosporin C-Biosyntheseweges dar, daß keine Regulation durch Glukose aufweist.

4) In vielen Hyphenpilzen wird eine glukoseabhängige transkripttonale Repression durch Transkriptionsfaktoren der CREA/CRE1-Familie vermittelt. Innerhalb der vorliegenden Arbeit konnte erstmals das creA-Gen aus A. chrysogenum aus einer Lambda-Genbank isoliert werden Nur Genprodukt CREA ist in allen funktionalen Domänen konserviert und weist große Homologien zu CRE1 aus Trichoderma reesei auf. Zudem liegt eine glukoseabhängige positive Regulation von creA in A. chrysogenum vor, die eine Autoregulation sowie eine bisher unbekannte Aktivatorfunktion vermuten läßt.

5) Durch das Einbringen zusätzlicher Kopien des creA-Gens in das Genom von A. chrysogenum A3/2 konnte eine transkripttonale Glukoseregulation des vorher in diesem Stamm dereguliertenpcbC-Gens erreicht werden, die mit der im Wildtyp ATCC 14553 beobachteten übereinstimmte. Gleichzeitig wurde die transkripttonale Repression des ceEF-Gens verstärkt. Hieraus läßt sich schließen, daß CREA an der Glukoseregulation der beiden Gene beteiligt ist. Ein entsprechendes Modell der CREA-Wirkung wird vorgestellt.

Glukose ist den Ergebnissen zufolge ein wichtiger Faktor in der negativen Regulation der Cephalosporin C-Biosynthese in A. chrysogenum. Mit dem Glukoserepressor CREA konnte erstmals ein Transkriptionsfaktor aus A. chrysogenum identifiziert werden, der an einem regulativen Prozeß in diesem Hyphenpilz beteiligt ist. Langfristig kann die Aufklärung nährstoffabhängiger und stammspezifischer Regulationsmechanismen zur Optimierung der Anzucht in industriellen Prozessen sowie zur gezielten Stammverbesserung auf gentechnischer Ebene dienen.

Inhaltsverzeichnis top ↑

I. Einführung 1

1. Einleitung 1
2. Signaltransduktionswege bei der Glukoseinduktion in Saccharomyces
cerevisiae 1
3. Glukoserepression in Saccharomyces cerevisiae 4
3.1. Verschiedene Ebenen der Repression 4
3.2. Der SNF1-Komplex: "Zellenergie-Sensor" bei der Derepression 5
3.3. Struktur des Transkriptionsregulators MIG1 7
3.4. Modell der Repression durch MIG1 8
3.5. Mehrfache Kontrollmechanismen der Repression 10
3.6. Beteiligung weiterer Glukoserepressoren an der Regulation der
Genexpression 12
3.7. Bedeutung von cAMP für die Repression 12
4. Glukoseregulation in Hyphenpilzen 13
4.1. Signaltransduktionswege und glukoseregulierte Stoffwechselwege in
Aspergillus nidulans 13
4.2. Klonierung des Transkriptionsregulators CREA 14
4.3. Mechanismen der Glukoserepression in Aspergillus nidulans 16
4.4. Identifizierung des Glukoserepressors aus Trichoderma reesei: CRE1 17
4.5. Aufbau und Regulation von CRE1 17
4.6. Aktivierung von CREA durch Phosphorylierung 18

5. Ausblick 19
II. Problemstellung 21
III. Material und Methoden 25
1. Material 25
1.1. Stämme 25
1.2. Genbibliothek 25
1.3. Plasmide 26
1.4. Oligonukleotide 26
1.5. Chemikalien 27
1.6. Enzyme 27

1.7. Häufig verwendete Puffer 27
1.8. Nährmedien 28
2. Methoden 28
2.1. Kulturbedingungen 28
2.2. Transformationen 29
2.3. Isolierung von Nukleinsäuren 29
2.4. Gelelektrophoresen 30
2.5. Southern-Blotting und DNA-DNA-Hybridisierungen 30
2.6. Northern-Blotting und DNA-RNA-Hybridisierungen 31
2.7. Untersuchungen der Transkriptstabilität in A. chrysogenum 31
2.8. Densitometrische Auswertung von Autoradiogrammen 31
2.9. Radioaktive Markierung von DNA 31
2.10. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 32
2.11. DNA-Sequenzierung 32
2.12. Oligonukleotidsynthese 32
2.13. In vitro Rekombination von DNA 32
2.14. Auswertung von Nukleotidsequenzen 32
2.15. Nachweis von Zuckern im Kulturüberstand 33
2.16. Nachweis von ß-Lactam-Antibiotika 33
2.17. Überexpression und Isolation von Proteinen und Proteinfragmenten in
E. coli 34
2.18. Herstellung polyklonaler Antiseren 34
2.19. Proteinisolierung aus A. chrysogenum 34
2.20. Bestimmung der Proteinkonzentration 34
2.21. Western-Blotting und Deglykosilierung 34
2.22. Immunodetektion 35
2.23. Quantitative Bestimmung der Aktivität von Reportergenen 35
2.24. Sicherheitsbestimmungen 35
IV. Ergebnisse 36
1. Wirkung von Glukose auf die Cephalosporin C-Biosynthese in
A. chrysogenum 36
1.1. Auswahl eines zur Anzucht geeigneten Mediums 36
1.2. Beeinflussung der Produktion von ß-Lactam-Antibiotika 39
1.3. Untersuchung der Transkriptmengen der Cephalosporin
C-Biosynthesegene 41
1.4. Stabilität des cefEF-Transkripts in Gegenwart von Glukose 45
1.5. Beeinflussung der Proteinmengen der pcbC-, cefEF- und
cefG-Genprodukte 47
1.5.1 Herstellung von polyklonalen Antiseren gegen die IPN-Synthase und
DAC-Acetyltransferase 47
1.5.2 Nachweis der Cephalosporin C-Biosynthesegenprodukte in A. I
chrysogenum 48
2. Versuche zur Identifizierung von regulativ wirkenden cis-Elementen
durch quantitative Reportergenmessungen 51

3. Isolierung potentiell trans-wirkender Faktoren bei der
Glukoserepression in A. chrysogenum 54
3.1 Klonierung des creA-Gens 54
3.2 Regulation von creA in verschiedenen Stämmen von A. chrysogenum 60
3.3 Transformation von A. chrysogenum mit zusätzlichen Kopien des
creA-Gens und Analyse der Transformanten 62

3.3.1 Auswahl geeigneter Kotransformanten 62
3.3.2 Wuchsgeschwindigkeit und Cephalosporin C-Produktion 64
3.3.3 Northern-Analysen der pcbC-, cefEF- und creA-Transkriptmengen in
den Kotransformanten 65
V. Diskussion 70
1. Die ß-Lactam-Biosynthese unterliegt einer negativen
Glukoseregulation 70
1.1 Etablierung geeigneter Untersuchungsbedingungen 71
1.2 Die Expression des pcbAB-Gens weist in den ß-Lactam-Produzenten
artspezifische Unterschiede auf 72
1.3 Das pcbC-Gen ist in A. chrysogenum stammspezifisch auf transkripttonaler
Ebene reguliert 73
1.4 Das cef PF-Gen ist in A. chrysogenum transkriptional reprimiert 75
1.5 Eine Glukoserepression des cefG-Gens konnte in A. chrysogenum nicht
beobachtet werden 78
1.6 Glukose beeinflußt den pH-Wert des umgebenden Milieus 80
1.7 Die Glukoseregulation betrifft die Expression mehrerer Cephalosporin C-
Biosynthesegene 82
2. Mechanismen der Glukoserepression bei der Cephalosporin
C-Biosynthese 84
2.1 Reportergenanalysen sind in A. chrysogenum nur bedingt zum Nachweis von
Regulationsereignissen geeignet 84
2.2 Die Promotoren der glukoseregulierten pcbC- und cefEF-Gene weisen
putative CREA-Bindestellen auf 86
2.3 Das CREA-Protein aus A. chrysogenum: Einordnung in die Reihe bekannter
pilzlieber Glukoserepressoren 89
2.4 CREA hat möglicherweise eine Aktivatorfunktion 95
2.5 CREA ist an der Regulation der Cephalosporin C-Biosynthese
beteiligt 98
2.5.1 Die Kotransformanten sind in der Cephalosporin C-Produktion
beeinträchtigt 99
2.5.2 CREA reprimiert die Transkription von pcbC und cefEF 100
2.5.3 Existieren weitere glukoseabhängige Regulatoren der Cephalosporin C-
Biosynthese? 102
2.5.4 Modellvorstellung der Regulation durch CREA 104
VI. Zusammenfassung 106
VII. Summary 108
VIII. Literatur 110
IX. Anhang 130