cover

Thorsten Voß:

Molekularbiologische Untersuchungen zur Gibberellin-Biosynthese des Asomyceten Gibberella fujikuroi

[Molecular biological study of gibberellin biosynthesis in the rice pathogenic ascomycete Gibberella fujikuroi]

2000. IX, 112 Seiten, 31 Abbildungen, 12 Tabellen, 14x22cm, 280 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 186)

ISBN 978-3-443-59088-8, brosch., price: 41.00 €

in stock and ready to ship

Order form

BibTeX file

Keywords

MolekülbiologischBiosytheseChromosomGenCluster

Contents

Synopsis top ↑

Using conventional transformation techniques, 24 mutants of the rice pathogenic ascomycete Giberella fujikuroi were generated, which are unable to produce gibberellins. These strains together with the two REMI mutants generated by Linnemannstöns (1996) are characterised. In 25 of them a vector integration at a specific site, a so called 'hot spot' of recombination, in their genome took place. All strains carry a large deletion, which covers the gene cluster responsible for g ibberellin-biosynthesis which is the reason for the gib-phenotype. PFGE-experiments show that these fungal strain lost 300-400 kb of their chromosome no. 4 and that this deletion is not directly linked with the site of the vector integrations. The gene cluster of the gibberrellin-biosynthesis could be also located on chromosome no. 4 and a chromosome map was created. In this map the genes area G.f., creA G.f., nmr G.f., hmg, fdp, ggsl, niaD and phs, which are thougt to be involved in gibberellin-biosynthesis, could be attached to specific chromosomes of G. fujikuroi.

A DNA segment up stream of the orf3-gene was analysed for unknown genes of the genecluster of the gibberellin-biosynthesis. A fragment of 9.6 kb was sequenced and characterised. Four open reading frames were discovered and their homologies to known genes were checked. They code for an aldehyde dehydrogenase (ald-gene), an alcohol dehydrogenase (alc-gene), a protein with four ankyrin domains (ark-gene) and a membrane transporter (smt-gene). The aid-, ale- and smt-gene were only expressed in the main production phase of gibberellins in contrast to the transcript of the ark-gene, which was also detectable in small amounts in the early growth phase. The aldehyde and the alcohol dehydrogenase could be involved in the enzymatic chain of the gibberellin-biosynthesis, the ANK-protein may be take part in regulation of the pathway and the membrane transporter could be responsible for the excretion of gibberellins.
The analysis of the promoter regions of these genes gave no clear evidence for their real function. The smt-gene was disrupted, but the characterisation of these mutants could not prove the question whether they belong to the gene cluster of the gibberellin-biosynthesis or not.

Kurzfassung top ↑

Durch konventionelle Transformation wurden 24 Mutant en von Giberelly fujikuroi erzeugt, die nicht mehr in der Lage sind, Gibberelline zu bilden. Diese wurden zusammen mit den beiden bereits von Linnemannstöns (1996) mittels REMI produzierten gib-Stämmen charakterisiert. Bei 25 dieser Stämme fand die Vektorintegrationen an einer bestimmten Stelle im Genom statt, einem sogenannten "hot spot" der Rekombination. Alle Stämme weisen eine große Deletion auf, die unter anderem das gesamte "Gencluster" der Gibberellin-Biosynthese umfaßt, und somit die Ursache für den "gib-Phänotyp" ist. Mittels PFGE konnte gezeigt werden, daß die Deletion ca. 300 bis 400 kb umfaßt, das Chromosom 4 betrifft und nicht direkt mit dem Ort der Vektorintegration gekoppelt ist. Auch das "Gencluster" der Gibberellin-Biosynthese wurde auf Chromosom 4 nachgewiesen. Zudem wurde eine Chromosomenkarte erstellt, in der die Gene areA G.f., creA G.f., nmr G.f., hmg, fdp, ggsl, niaD und phs, die mit der Gibberellinproduktion in Zusammenhang stehen oder stehen könnten, den Chromosomen von G. fujikuroi zugewiesen werden konnten.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein DNA-Bereich jenseits des orf3-Gens auf bisher unbekannte Gene des "Genclusters" der Gibberellin-Biosynthese hin untersucht. Es wurde ein Abschnitt von 9,6 kb sequenziert und charakterisiert, wobei vier offene Leserahmen entdeckt wurden. Anhand von Sequenzvergleichen mit bekannten Genen und Proteinen konnten sie als Gene identifiziert werden, die für eine Aldebyddehydrogenase (ald-Gen), eine Alkoholdehydrogenase (arc-Gen), ein Protein mit Ankyrindomänen (ank-Gen) und einen Membrantransporter (smt-Gen) kodieren. Das aid-, alc- und smt-Gen wird während der Hauptproduktionsphase der Gibberelline exprimiert, wohingegen das Transkript des ank-Gens in geringerer Menge auch schon während der Wachstumsphase nachgewiesen wurde. Die Aldehyd- und die Alkoholdehydrogenase könnten im Rahmen der Biosynthese der Gibberelline, das Ank-Protein bei deren Regulation und der Membrantransporter bei der Ausschleusung der Gibberelline aus der Zelle eine Rolle spielen. Die Promotoranalysen der einzelnen Gene lieferten sowohl Indizien für als auch gegen deren Zugehörigkeit zum "Gencluster" der Gibberellin-Biosynthese. Für das smt-Gens wurden "Gene Disruption"-Mutanten erzeugt, doch brachte ihre Analyse keine Bestätigung dafür, daß dieses Gen zum "Gencluster" gehört. Eine weitere Charakterisierung dieser vier neu entdeckten Gene, beispielsweise durch erneute, abgeänderte Versuche sie zu inaktivieren, wäre von großer Bedeutung für die weitere Aufklärung der Biosynthese der Gibberelline in G. Fujikuroi

Inhaltsverzeichnis top ↑


Danksagung VII
Abkürzungen VIII
1 Einleitung 1
1.1 Von der Epidemie zur Agrochemikalie 1
1.2 Die systematische Stellung von Gibberella fujikuroi 2
1.3 Die Gibberelline 3
1.4 Die Gibberellin-Biosynthese 4
1.4.1 Phase I: Der Isoprenoid-Biosyntheseweg und die Bildung
von ent-Kauren 4
1.4.2 Phase II: Vom ent-Kauren zum GA12-Aldehyd 6
1.4.3 Phase III: Die Synthese biologisch aktiver Gibberelline 7
1.4.4 Kompartimentierung und Regulation der Gibberellin-Biosynthese 8
1.4.5 Deaktivierung der Gibberelline 10
1.5 Wege zur Isolierung von an der Gibberellin-Biosynthese
beteiligter Gene 10
1.6 Das "Gencluster" der Gibberellin-Biosynthese bei
G. fujikuroi 12
1.7 Zielsetzung der Arbeit 13
2 Material und Methoden 14
2.1 Stämme 14
2.1.1 Escherichia coli 14
2.1.2 Gibberella fujikuroi 14
2.1.3 Oryza sativa 14
2.2 Plasmide 14
2.3 Primer 15
2.3.1 Sequenzierungs-Primer 15
2.3.2 Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Primer 15
2.4 Chemikalien 15
2.5 Enzyme 16
2.6 Medien 16
2.7 Molekulargenetische Arbeitsmethoden 17
2.7.1 Präparation von Nukleinsäuren 17
2.7.1.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 17
2.7.1.2 Isolierung von DNA aus lambda-Phagen 17
2.7.1.3 Isolierung von genomischer DNA aus G. fujikuroi 17
2.7.1.4 RNA-Isolierung 18
2.7.2 Gelelektrophorese und Restriktion von Nukleinsäuren 18
2.7.2.1 Restriktion und Gelelektrophorese von DNA 18
2.7.2.2 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 19
2.7.2.3 RNA-Gelelektrophorese 19
2.7.2.4 Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) 19
2.7.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 20
2.7.3.1 PCR mit genomischer DNA 20
2.7.3.2 RT-PCR 21
2.7.4 Transfer von Nukleinsäuren 21
2.7.4.1 Southern-Blot 21
2.7.4.2 Koloniefilter 21
2.7.4.3 Phagenplaquefilter 22
2.7.4.4 Northern Blot 22
2.7.5 Hybridisierung 22
2.7.5.1 Sondenvorbereitung 22
2.7.5.2 DNA/DNA-Hybridisierung 23
2.7.5.3 DNA/RNA-Hybridisierung 23
2.7.6 Sequenzierung von DNA 23
2.7.7 Transformation von E. coli 24
2.7.7.1 Klonierung von DNA-Fragmenten 24
2.7.7.2 "In vivo Excision" von lambda-Uni-ZAP XR-Klonen 24
2.7.8 TransLormation von G. fuLikurOi 24
2.8 Dünnschichtchromatographie (DC) 25
2.9 "High Pressure Liquid Chromatographie" (HPLC) 26
2.10 Reis-Biotest 26
Ergebnisse 27
3.1 Erzeugung und Analyse von Transformanten mit Störungen
in der Gibberellin-Biosynthese 27
3.1.1 TransLormation von G. fuLiFuroi mit pAN7- 1 27
3.1.2 Bestimmung der Phänotypen der Transformanten 28
3.1.3 Analyse der Vektorintegrationen in den gib-Stämmen 30
3.1.4 Southern-Analyse der gib-Stämme 32
3.1.5 Chromosomenanalyse 35
3.1.5.1 Pulsfeld-Gelelektrophorese 35
3.1.5.2 Erstellung einer Chromosomenkarte 36
3.2 Sequenzanalyse flankierender Bereiche des "Genclusters"
der Gibberellin-Biosynthese 40
3.2.1 Subklonierung und Sequenzierung der 3'-Bereiche von orf 3 40
3.2.2 Das Aldehyddehydrogenase-Gen 41
3.2.3 Das Alkoholdehydrogenase-Gen 46
3.2.4 Das Ankyrindomänen-Gen 50
3.2.5 Das Membrantransporter-Gen 53
3.2.6 Ermittlung der cDNA-Sequenzen 56
3.2.7 Transkriptnachweise 57
3.3 Inaktivierung des smt-Gens durch "Gene Disruption" 59
3.3.1 Konstruktion des "Gene Disruption"-Vektors 59
3.3.2 Transformation von G. fujikuroi mit pSMTAUS 59
3.3.3 Analyse der Transformanten 62
3.4 "Chromosome Walking" 63
4 Diskussion 64
4.1 Deletionen des "Genclusters" der Gibberellin-Biosynthese 64
4.2 Die Suche nach weiteren Genen des "Genclusters"
der Gibberellin-Biosynthese 69
4.2.1 Das Aldehyddehydrogenase-Gen 69
4.2.2 Das Alkoholdehydrogenase-Gen 73
4.2.3 Das Ankyrindomänen-Gen 77
4.2.4 Das Membrantransporter-Gen 78
4.2.5 Zusammenfassende Abschätzung 81
5 Zusammenfassung 84
6 Summary 85
7 Literatur 86
8 Anhang 101