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Michael Pfeil:

Funktionsanalyse und molekulare Charakterisierung der bifunktionalen Expandase/Hydroxylase aus dem Hyphenpilz Acremonium chrysogenum

2001. IX, 113 Seiten, 25 Abbildungen, 3 Tabellen, 14x22cm, 280 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 188)

ISBN 978-3-443-59090-1, brosch., price: 36.00 €

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Keywords

HyphenpilzAcremonium chrysogenumExpandaseHydroxylaseFunktionsanalyse

Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

In der vorliegenden Arbeit wird die molekulare Charakterisierung der bifunktionalen Expandase/Hydroxylase aus dem Hyphenpilz Acremonium chrysogenum vorgestellt. Dieser Hyphenpilz synthetisiert das ß-Lactam-Antibiotikum Cephalosporin C. In der Biosynthese von Cephalosporin C wird Penicillin N durch die Expandase-Reaktion in Desacetoxycephalosporin C und durch die Hydroxylase-Reaktion in Desacetylcephalosporin C umgesetzt. Mit Hilfe eines Strukturmodells wurde die Frage geklärt, ob die beiden Reaktionen in einem gemeinsamen oder zwei getrennten Aktivitätszentren katalysiert werden.

Content Description top ↑

This work presents the molecular characterization of the bifunctional enzyme expandase/hydroxylase from the fungus Acremonium chrysogenum. This fungus synthesizes the ß-lactam-antibiotic cephalosporin C. In the first step of the cephalosporin c pathway the expandase/hydroxylase catalyzes the formation of the ring-expanding reaction of penicillin N to deacetylcephalosporin C (DAOC), which is subsequently hydroxylated with the same enzyme. The enzymatic activity was assayed, and in order to characterize the active site a structural model was created.

Inhaltsverzeichnis top ↑

I. Einführung

1. Einteilung und Klassifizierung Sauerstoff-verbrauchender Enzyme 1
2. Der Reaktionstyp als Charakteristikum für die Einteilung der
Dioxygenasen 2
3. Eine weitere Gruppe von Dioxygenasen wird durch die Abhängigkeit von
einem Cosubstrat mit einer 2-Oxogruppe charakterisiert 3
3.1 Reaktionsmechanismus einer 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenase
mit Hydroxylase-Aktivität 6
3.2 Bifunktionale Dioxygenasen mit Hydroxylase- und Epoxidase-Aktivität 8
3.3 Cyclasen und Desaturasen als 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen 8
3.4 Verwendung alternativer Cosubstrate mit einer 2-Oxogruppe 9
4. In der Biosynthese der ß-Lactam-AntiSiotika katalysieren Dioxygenasen
verschiedene Syntheseschritte 10
4.1 Enzyme der ersten gemeinsamen Stufe der ß-Lactam-Biosynthese aller
Produzenten 11
4.2 Die Biosynthese der Penicilline durch Penicilllum chrysogenum und
Aspergillus nidulans 13
4.3 Biosynthese der Cephalosporine und Cephamycine 15
4.4 Die Cephalosporin C-Biosynthese bei Acremonium chrysogenum 17
4.5 Binsyntheseschritte der prokaryotischen Produzenten zum Endprodukt
Cephamycin C 18
5. Ausblick 20
II. Problemstellung
1. Ziele der industriell genutzten Biotechnologie 22
2. Problemstellung 23
III. Material und Methoden
1. Material
1.1 Stämme 25

1.2 Plasmide 25
1.3 Oligonukleotide 27
1.4 Nährmedien 28
1.5 Häufig verwendete Puffer 29
1.6 Chemikalien 29
1.7 Enzyme 30
2. Methoden
2.1 Kulturbedingungen 30
2.2 Transformation 30
2.3 Isolierung von Nukleinsäuren 30
2.4 Gelelektrophorese 31
2.5 Radioaktive Markierung von DNA 31
2.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 31
2.7 Elution von DNA aus Agarosegelen und Reinigung von DNA-Fragmenten 31
2.8 DNA-Sequenzierung 32
2.9 Oligonukleotidsynthese 32
2.10 In vitro-Mutagenese und Klonierung der DNA-Fragmente 32
2.11 Synthese und Reinigung rekombinanter Proteine 34
2.11.1 Synthese der rekombinanten Proteine 34
2.11.2 Isolation des nativen Proteins 34
2.11.3 Renaturierung und Dialyse von Proteinen in Einschlußkörpern 34
2.11.4 Aufreinigung der Histidin-Fusionsproteine 35
2.12 Bestimmung der Proteinkonzentration 35
2.13 Western-Blot und Immunodetektion 35
2.14 Funktionsanalyse der Expandase/Hydroxylase in einem enzymatischen
Test 35
2.15 Quantitativer Nachweis von ß-Lactam-Verbindungen 36
2.16 Modellierung von 3-D-Proteinstrukturen 37
2.17 Auswertung von Nukleotidsequenzen und allgemeine Software 38
2.18 Sicherheitsbestimmungen 38
IV. Ergebnisse
1. Synthese und Aufreinigung der Expandase/Hydroxylase aus A. chrysogenum 9
1.1 Konstruktion des Expressionsvektors und des Synthesesystems 39
1.2 Synthese und Reinigung des Fusionsproteins 40
2. Funktionsanalyse der Expandase/Hydroxylase mit Enzymmessungen 43
2.1 Enzymaktivitätsvergleich des nativen und renaturierten Wildtyp-Proteins 43
2.2 Bestimmung des pH- und Temperatur-Profils der Expandase/Hydroxylase 45
3. Homologievergleich der Primärstruktur der Expandase/Hydroxylase mit
Primärstrukturen verwandter Proteine und weiteren Dioxygenasen 47
4. 3-D-Strukturmodellierung zur Charakterisierung der
Expandase/Hydroxylase 50
4.1 Vergleich der Primär- und Sekundärstrukturen der DAOCS aus
S. clavulligerus mit der Expandase/Hydroxylase aus A. chrysogenum 50
4.2 Strukturmodellierung der Expandase/Hydroxylase aus A. chrysogenum 51
4.3 Qualitätskontrolle der modellierten Struktur der Expandase/Hydroxylase 53
4.4 Gesamtbeurteilung der Modellstruktur der Expandase/Hydroxylase 55
5. Lokalisierung von "Reaktionshöhlen" 56
6. Analyse funktions- und strukturrelevanter Aminosäurereste durch in vitro-
Mutagenese und Bestimmung der Aktivitäten der modifizierten Proteine 60
6.1 Einfluß der Mutationen auf die Expression bei der Synthese und
Aufreinigung 60
6.2 Auswirkungen von Modifikationen in konservierten und
funktionsrelevanten Bereichen des putativen Aktivitätszentrums der
Expandase/Hydroxylase 62

V. Diskussion

1. Die funktionale Synthese der Expandase/Hydroxylase ist mit dem
prokaryotischen Expressionssystem Escherichia coli möglich 65
2. Die Expandase/Hydroxylase hat nur eine Eisen-Koordinierungsstelle und
eine Bindestelle für 2-Oxoglutarat 67
2.1 Die Eisen-Koordinierungsstelle besteht aus zwei Histidinresten und
einem Asparaginsäurerest 67
2.2 Im konservierten SequenzDereich befindet sich die einzige Bindestelle
für 2-Oxoglutartat 69
2.3 Die Tertiärstruktur der Expandase/Hydroxylase weist mit dem
"Jelly-roll"-Motiv Ähnlichkeiten zur IPNS und zur DAOCS auf 70
2.4 Die Aktivitätszentren der IPNS, der DAOCS und der modellierten
Expandase/Hydroxylase weisen eine große Strukturähnlichkeit auf 71
2.5 Eine absolute Trennung der beiden Teilreaktionen ist in einem
bifunktionalen Reaktionszentrum nicht moglich 73
3. Möglicher Reaktionsmechanismus der bifunktionalen
Expandase/Hydroxylase 78
3.1 Vergleich der katalysierten Reaktionstypen innerhalb der ß-Lactam-
Biosynthese 79
4. Ziele der modernen Stamm- und Prozeßentwicklung 82
3.1 Kenntnisse der molekularen Charakterisierung der Expandase/
Hydroxylase könnten für die industrielle Stamm- und Prozeßentwicklung
verwendet werden 82
4.2 Verfahrenstechnische Aspekte der industriellen Prozeßentwicklung 84
VI. Zusammenfassung 85
VII. Summary 87
VIII. Literatur 89
IX. Anhang 110