cover

Frank Windhofer:

Untersuchungen zur Aktivität des Transposons Restless in dem heterologen Wirt Neurospora crassa

2002. 143 Seiten, 33 Abbildungen, 11 Tabellen, 14x23cm, 340 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 193)

ISBN 978-3-443-59095-6, brosch., price: 42.00 €

in stock and ready to ship

Order form

BibTeX file

Keywords

TransposonRestlessHyphenpilzNeurospora crassa

Contents

Zusammenfassung top ↑

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Aktivität des Transposons Restless in dem Hyphenpilz Neurospora crassa analysiert. Dabei wurden Untersuchungen zum Nachweis der Restless-Exzision und zum Einfluß wirtsspezifischer Faktoren auf die Aktivität dieses Transposons durchgeführt. Zusammengefaßt wurden folgende Ergebnisse erhalten:

1. Es wurden verschiedene Vektorkonstrukte für die Transformation von N. crassa hergestellt. Diese Vektoren enthielten unterschiedliche Restless-Kopien. Mit Hilfe PCR-vermittelter in vitro Mutagenese wurden Veränderungen innerhalb der Restless-Sequenz vorgenommen, um eine Optimierung der Restless-Aktivität in dem heterologen Wirt zu erzielen.

2. Das Transposon Restless wurde erfolgreich in den Hyphenpilz N. crassa transformiert. Integriert das Transposon in vielen Kopien in das Genom von N. crassa, so wird es in vegetativen Hyphen methyliert. Diese Methylierung beruht auf einem hohen TpA-Dinukleotid-Verhältnis in bestimmten Abschnitten der Restless-Sequenz. Wurde das Transposon jedoch mit einer einzelnen Kopie über homologe Rekombination in der Nähe des his-3 Lokus integriert, so wurde es nicht methyliert. Transformanten mit einer einzelnen integrierten Restless-Kopie waren die Grundlage für die weiteren Untersuchungen zur Aktivität des Restless-Transposons in N. crassa.

3. Das Restless-Transkript wird in N. crassa gespleißt. Der Mechanismus des alternativen Spleißens von Restless wurde durch Veränderung der Intron-Spleißsequenzen näher untersucht. Die ursprüngliche Restless Intron-Sequenz wird in N. crassa nicht optimal erkannt und somit nicht effizient gespleißt. Eine Veränderung der 5'-Spleiß-Sequenz zu einer Konsensus-Sequenz für Hyphenpilze optimierte die Spleiß-Effizienz des Restless-Transkriptes. Die Modifikation an der 5'-Intron-Sequenz hatte jedoch keinen Einfluß auf das alternative Spleißen des Restless-Elementes. Ein optimiertes alternatives Spleißen konnte durch Modifikation der 3'-Spleiß-Sequenz erzielt werden. Der Spleiß-Mechansimus konnte vermutlich nur dann zwischen den beiden Kodonen unterscheiden, wenn an einer der zwei 3'-Spleiß-Sequenzen eine Modifikation vorlag.

4. Das Transposon Restless ist ein aktives Klasse II Element im heterologen Wirt N. crassa. Es wurden Exzisionsereignisse mittels PCR-Analysen nachgewiesen. Restless exzisiert sowohl korrekt als auch inkorrekt. Die korrekte Restless-Exzision hinterließ keine "footprints", so daß die ursprüngliche "Wildtyp-Situation" wiederhergestellt wurde. Bei der inkorrekten Exzision blieben terminale DNA-Bereiche des Transposons nach der Exzision zurück. N. crassa-Isolate, bei denen diese Exzisionen nachgewiesen wurden, konnten durch zwei unabhängige Selektionssysteme erzielt werden, eine "Vorwärts-Selektion" und eine dominante Selektion. Beide Selektionssysteme ergaben Isolate, in denen identische Exzisionsprodukte ermittelt wurden.

5. In dem heterologen Wirt Neurospora crassa aber auch im homologen System Tolypocladium inflatum konnten erstmals Derivate des Transposons Restless mit internen Deletionen ermittelt werden. Diese Derivate sind vermutlich das Ergebnis einer inkorrekten Exzision von Restless, bei der interne Bereiche unterschiedlicher Größe zwischen repetitiven DNA-Sequenzen verloren gegangen sind. Der Aufbau und die Entstehung dieser (Rst-Elemente weisen deutliche Homologien zu den Ds-Elementen aus dem Mais auf.

6. Durch den Nachweis veränderter Hybridisierungsmuster bei verschiedenen N. crassa Isolaten konnten erstmals in einem heterologen Organismus putative Transpositionsereignisse für das Restless-Element nachgewiesen werden. Ausgehend von Transformanten mit einer einzelnen Restless-Kopie traten zusätzliche Banden bei der Southern-Hybridisierung auf. Das Restless-Element transponiert somit vermutlich bevorzugt während der Replikation. Dieser Mechanismus der Transposition wurde bereits für das Activator-Elemente im Mais nachgewiesen.

In dieser Arbeit wird erstmals die Aktivität des Transposons Restless in dem Hyphenpilz Neurospora crassa beschrieben. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Transposition von Restless ein sehr komplexer Vorgang ist, der von sehr unterschiedlichen Faktoren beeinflußt wird. Neben einer korrekten Restless-Sequenz muß die Methylierung repetitiver Sequenzen, die Effektivität des alternativen Spleißens und der Zeitpunkt der Restless-Transposition in dem heterologen System N. crassa berücksichtigt werden. Bei einer Optimierung der Restless-Aktivität unter Berücksichtigung dieser Faktoren können die Grundlagen geschaffen werden, das Transposon Restless als molekulares Werkzeug für die Etablierung eines Transposon-Mutagenese-Systems zu verwenden.

Rev.: Mycotaxon, vol. 106, issue 9, p. 1120 top ↑

This study reports investigations of the transposable element Restless in Neurospora crassa carried out because of interest in the effects of the excision of the element on the host. Constructs from different host organisms were made and successfully integrated into N. crassa, becoming methylated in some cases. Restless transcript processing was analysed by reverse transcription PCR. Incorrect and correct excision events were detected, no "fottprints" remaining when this was effected correctly. The behaviour of the transposon was also examined in the momologous host Tolypocladium inflatum where deletion derivates due to imprecise excision could be analysed; internal sequences were left between direct repeats. This is the first active transposon introduced into N. crassa, its activity depending on the correct sequence, number of integrated copies efficiency of alternative splicing, and the time of transposition. While the topic may appear particularly specialized, the technology developed in this study can be expected to be of interest to those concerned with the development of transposon-based gene-tagging systems in filamentous fungi in general.

Mycotaxon, vol. 106, issue 9, p. 1120

Inhatsverzeichnis top ↑

I. Einführung 1
1. Einleitung 1
2. Transposonen in Hyphenpilzen 3
2.1 Klasse I Retroelemente
2.2 Klasse II DNA-Elemente 8
3. Die Familie der hAT-Transposonen 12
3.1 Die Elemente der hAT-Familie sind weit verbreitet 12
3.2 Allgemeine Merkmale der hAT-Transposonen 17
4. Die Auswirkung von Transposonen auf das Genom von Hyphenpilzen 18
5. Die DNA-Methylierung von repetitiven Sequenzen in Hyphenpilzen 19
6. Anwendung von Transposonen 21
II. Problemstellung 22
III. Material und Methoden 24
1. Material 24
1.1 Stämme 24
1.2 Oligonukleotide 25
1.3 Plasmide 26
1.4 Chemikalien 29
1.5 Membranen und Papiere 29
1.6 Enzyme 30
1.7 Häufig verwendete Puffer und Lösungen 30
1.8 Nährmedien 30
2. Methoden 31
2.1 Kulturbedingungen 31
2.2 Isolierung von Nukleinsäuren 31
2.2.1 Plasmid-DNA aus Escherichia coli 31
2.2.2 Gesamt-DNA aus Hyphenpilzen 31
2.2.3 Gesamt-RNA aus Hyphenpilzen 32
2.3 Transformationen 32
2.3.1 Transformation von E. coli 32
2.3.2 Protoplastierung und Transformation von Neurospora crassa 32
2.3.3 Elektroporation von Neurospora crassa Konidien 33
2.4 Selektionssysteme von N. crassa 33
2.4.1 Selektion putativer N. crassa-Mutanten mit Defekt im mtr-Gen 33
2.4.2 Dominante Selektion von N. crassa auf Zeocin-Resistenz 34
2.5 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA 34
2.5.1 Agarosegele 34
2.5.2 Polyacrylamidgele 34
2.6 Elution von DNA aus Agarosegelen 35
2.7 Radioaktive Markierung von Nukleinsäuren 35
2.8 Southern Blot und DNA-DNA-Hybridisierungen 35
2.9 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 36
2.9.1 Standard-PCR 36
2.9.2 Reverse Transkription 36
2.9.3 Asymmetrische PCR 36
2.10 PCR-vermittelte in vitro Mutagenese 37
2.10.1 In vitro Mutagenese zum Austausch einzelner Nukleotide 37
2.10.2 In vitro Mutagenese zum Austausch mehrerer Nukleotide 37
2.11 Herstellung eines T-Vektors 38
2.12 DNA-Sequenzierung 38
2.13 Auswertung von Nukleotid-Sequenzen 38
2.14 Graphische Darstellung von Vektorkarten 38
2.15 Digitale Bildbearbeitung 38
2.16 Sicherheitsbestimmungen 38
IV. Ergebnisse 39
1. Das Transposon Restless im heterologen Wirt Neurospora crassa 39
1.1 Vektorkonstruktionen zur Transformation von N. crassa 39
1.2 Die Transformation von Restless-Vektoren in N. crassa 44
1.3 Untersuchung zur vegetativen Methylierung von Restless in N. crassa 47
2. Untersuchungen zum Spleißen von Restless in N. crassa 49
2.1 Vektorkonstruktionen und Transformation von N. crassa 49
2.2 Analyse von Restless-Transkripten in verschiedenen
N. crassa-Transformanten 52
2.3 Analyse der gespleißten Restless-Transkripte 54
3. Nachweis der Aktivität von Restless in N. crassa 58
3.1 Selektionssysteme zum Nachweis der Restless-Transposition 58
3.1.1 Nachweis der Exzision von Restless durch Vorwärts-Selektion mit
Hilfe des mtr-Gens 58
3.1.2 Nachweis der Exzision von Restless durch dominante Selektion
mittels Zeocin-Resistenz 63
3.2 Molekularer Nachweis der Restless-Transposition 66
4. Nachweis deletierter Restless-Kopien im homologen Wirt
Tolypocladium inflatum 69
V. Diskussion 73
1. Mechanismen zur Inaktivierung von repetitiven Sequenzen in N. crassa 73
1.1 Restless wird als repetitives Element in Neurospora crassa erkannt 75
1.2 Besteht ein Zusammenhang zwischen der DNA-Methylierung und der
Aktivität von Transposonen? 78
2. Das Restless-Transkript kann in dem Wirt N. crassa nachgewiesen
werden 80
2.1 Das alternative Spleißen von Restless ist ein komplexer Mechanismus 81
3. Das Restless-Element ist ein aktives Klasse II Transposon 84
3.1 Die Exzision von Restless in N. crassa ist ein seltenes Ereignis 84
3.2 Die Aktivität von Restless in N. crassa kann optimiert werden 85
3.3 Das Transposon Restless existiert als intaktes Element und als
Deletionsderivat 87
3.4 Repetitive Sequenzmotive und ihr Einfluß auf die Exzision des
Restless-Transposons 90
3.5 Restless hinterläßt in N. crassa keine "footprints" bei der
korrekten Exzision 92
3.6 Die Transposition von Restless findet bevorzugt während der
Replikation statt 96
4. Homologe und heterologe Transposition von mobilen genetischen
Elementen 99
VI. Zusammenfassung 103
VII. Summary 105
VIII. Literatur 107
IX. Anhang 135