I. Einführung 1

1. Einleitung 1
2. Funktionelle Charakterisierung des Transposase-Proteins 3
2.1 Struktur des Proteins 3
2.2 DNA-Bindung der Transposase 5
3. Regulation der Transposition 8
3.1 Transkriptionelle Regulation der Transposase-Gen-Expression 8
3.2 Einfluss der Transposase-Konzentration auf die Transposition 10
3.3 Wirtsspezifische Faktoren 11
4. Ausblick 13

II. Problemstellung 17

III. Material und Methoden 20

1. Material 20
1.1 Stämme 20
1.2 Nährmedien 20
1.3 Plasmide 20
1.4 Oligonukleotide 22
1.5 Sonden 22
1.6 Chemikalien 23
1.7 Enzyme 23
1.8 Häufig verwendete Puffer 23
2. Methoden 24
2.1 Kulturbedingungen 24
2.2 Isolierung von Nukleinsäuren 24
2.3 Transformationen 25
2.4 Gelelektrophorese 26
2.5 Elution von DNA aus Agarosegelen 26
2.6 In vitro Rekombination von DNA 26
2.7 Southern Blots und DNA/DNA-Hybridisierungen 26
2.8 Radioaktive Markierung von DNA 27
2.9 Oligonukleotid-Synthese 27
2.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 27
2.11 DNA-Sequenzierung 29
2.12 Deletionen mit Exonuklease III / Nuklease S1 30
2.13 Auswertung von Nukleotidsequenzen 30
2.14 Selektion von Restless-Exzisionsereignissen nach Überexpression
des Transposase-Gens aus T. inflatum in P. chrysogenum 30
2.15 Quantitative Bestimmung der ?-Galaktosidase-Expression in
A. chrysogenum 31
2.16 Digitale Bildbearbeitung 31
2.17 Sicherheitsmaßnahmen 31

IV. Ergebnisse 32

1. Aktivität und Expression des Transposons Restless in
Penicillium chrysogenum 32
1.1 Transposonaktivität 32
1.1.1 Kotransformation von P. chrysogenum mit verschiedenen
Transposon-Vektoren und Analyse der Transformanten 34
1.1.2 Detektion putativer Exzisionsereignisse durch Selektion auf
Phleomycin-Resistenz 36
1.1.3 Molekularer Nachweis von Exzisionsereignissen 38
1.2 Überexpression des Transposase-Gens in P. chrysogenum 41
1.2.1 Konstruktion von Expressionsvektoren 41
1.2.2 Tripletransformation von P. chrysogenum und Analyse der
Transformanten 43
1.2.3 Transkriptionelle Expression des Transposase-Gens 45
1.2.4 Alternatives Spleißen des Transposase-Transkriptes 47
1.2.5 Aktivität des Transposons Restless nach Überexpression des
Transposase-Gens 49
1.3 Analyse der Transposon-Deletionen 53
2. Regulation der Genexpression in Acremonium chrysogenum 55
2.1 Transkriptionelle Expression des Transposase-Gens in
A. chrysogenum 56
2.2 Funktionsanalyse des cefEF-Promotors aus A. chrysogenum 58
2.2.1 Konstruktion von Vektoren zur Reportergenanalyse 58
2.2.2 Kotransformation von A. chrysogenum und Identifizierung
von Transformanten 60
2.2.3 Charakterisierung des cefEF-Promotors durch Analyse der
Reportergenexpression 62

V. Diskussion 65

1. Das Transposon Restless exzisiert in P. chrysogenum 66
1.1 Die Exzision des Transposons Restless in P. chrysogenum ist ein
sehr seltenes Ereignis 66
1.2 Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Faktoren auf die
Exzisionsrate des Transposons 69
1.3 Das exzisierte Restless Element erzeugt in P. chrysogenum einen
"footprint" 71
1.4 Das exzisierte Restless Element integriert nicht wieder ins Genom 74
2. Das Transposase-Gen des Restless Elementes wird in P. chrysogenum
exprimiert 76
2.1 Eine gleichzeitige Transformation von drei verschiedenen Vektoren
ist in P. chrysogenum möglich 77
2.2 Das Transposase-Gen wird in P. chrysogenum und A. chrysogenum
transkribiert 78
2.3 In P. chrysogenum findet eine korrekte, jedoch nicht vollständige
Prozessierung des Restless-Transkriptes statt 79
2.4 Heterologe Genexpression auf der Basis des phoA-Promotors ist in
P. chrysogenum und A. chrysogenum möglich 81
2.5 Beide vom Transposase-Gen kodierten Proteine sind für die
Transposon-Aktivität notwendig 83
2.6 Die Überexpression des Transposase-Gens zeigt keinen Einfluss
auf die Aktivität des Restless Elementes 86
3. Rekombinationen zwischen direkten Sequenzwiederholungen erzeugen
Deletionen im Restless Element 88
4. Durch Deletionsanalysen des cefEF-Promotors aus A. chrysogenum werden
regulatorisch wirksame Sequenzbereiche identifiziert 90

VI. Zusammenfassung 95

VII. Summary 98

VIII. Literatur 100

IX. Anhang 119

In der vorliegenden Arbeit fand eine Untersuchung der Aktivität des
Transposons Restless aus T. inflatum in dem (-Lactam-Produzenten
P. chrysogenum statt. Als Voraussetzung für eine Transposition des
Restless Elementes in den Hyphenpilzen P. chrysogenum und
A. chrysogenum erfolgte zudem die Analyse der korrekten Expression des
Transposase-Gens in beiden Pilzen. Außerdem wurde ein Beitrag zur
Untersuchung von Regulationsmechanismen der Cephalosporin-Biosynthese
in A. chrysogenum geleistet. Nachfolgend die Zusammenfassung der
erzielten Ergebnisse:

1. Zur Untersuchung der Aktivität des Restless Elementes wurden
verschiedene Vektorkonstrukte in P. chrysogenum eingebracht und
putative Exzisionen mittels eines phänotypischen Tests
identifiziert. Weitere PCR- und Sequenzanalysen wiesen ein
Exzisionsereignis nach, welches einen für Transposonen der hAT-Familie
typischen "footprint" hinterließ.

2. Um eine Steigerung der Transpositionsrate zu erzielen, die durch
eine Zunahme der Transposase-Konzentration bewirkt werden sollte,
wurden Plasmide zur Überexpression des Restless-Transposase-Gens
mittels Tripletransformationen in P. chrysogenum eingebracht. In den
eingesetzten Überexpressionsplasmiden wurde das Transposase-Gen
entweder mit oder ohne das einzige Intron hinter den induzierbaren
phoA-Promotor aus P. chrysogenum kloniert.

3. Das Transkript des Restless-Transposase-Gens wurde in
P. chrysogenum Transformanten mittels RT-PCR
nachgewiesen. Sequenzanalysen ergaben, dass das Transkript nicht
vollständig, aber korrekt alternativ gespleißt wird. Beide durch die
alternative Prozessierung gebildeten unterschiedlichen Transkripte
wurden nachgewiesen. Das Mengenverhältnis des kürzeren Transkriptes
zum längeren Transkript lag bei 3:1. Untersuchungen von Konstrukten
mit veränderter Spleißerkennungssequenz des Restless-Introns zeigten,
dass die Spleiß-Effizienz wahrscheinlich durch die
5´-Intron-Erkennungssequenz beeinflusst wird.

4. Das Expressionssystem auf der Basis des heterologen phoA-Promotors
wurde auch in A. chrysogenum zur Überexpression des heterologen
Restless-Transposase-Gens erfolgreich eingesetzt und das Transkript
nachgewiesen.

5. Bei Aktivitätsuntersuchungen des Restless-Elementes nach der
Überexpression des Transposase-Gens wurden putative
Exzisionsereignisse nur bei Transformanten mit dem Intron-haltigen
Transposase-Gen identifiziert. Dieses zeigt, dass beide durch das
alternative Spleißen gebildeten Restless-Proteine für die
Transposon-Aktivität notwendig sind. Analysen der putativen Exzisionen
wiesen ein Exzisionsereignis nach, welches den gleichen "footprint",
wie das bereits beschriebene Exzisionsereignis zeigte.

6. Die bei der Selektion der Exzisionsereignisse gefundenen Deletionen
im Bereich des Restless Elementes wurden Sequenzanalysen
unterzogen. Diese ergaben, dass die Deletionen wahrscheinlich durch
homologe Rekombinationen zwischen direkten Sequenzwiederholungen
entstanden sind. Die Tatsache, dass die Deletionen nur bei Anwesenheit
einer aktiven Transposase stattfanden, weist darauf hin, dass die
Transposase ursächlich für entstandenen Deletionen sein könnte.

7. Um die Regulationsmechanismen der Cephalosporin-Biosynthese in dem
Hyphenpilz A. chrysogenum zu untersuchen, wurde die Promotorregion des
Cephalosporin-Biosynthesegens cefEF mittels Reportergenanalysen
charakterisiert. Auswirkungen von Promotor-internen Deletionen auf die
Expression des lacZ-Reportergens wurden ermittelt und sowohl
transkriptionsaktivierende, als auch reprimierende Sequenzbereiche
identifiziert.

Mit den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen wurden Grundlagen
geschaffen für den Einsatz des Transposons Restless als molekulares
Werkzeug in den (-Lactam-Produzenten P. chrysogenum und
A. chrysogenum. Die Etablierung des "Transposon tagging"-Systems kann
zur weiteren Aufklärung von Regulationsmechanismen der
Antibiotika-Biosynthese beitragen. Das Verständnis dieser Mechanismen
führt schließlich zur fortschreitenden Stammoptimierung und damit zur
Steigerung der Antibiotika-Biosynthese.