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Katarzyna Hauck:

Transposonen und Regulation der Genexpression bei den Antibiotika-produzierenden Pilzen Penicillium chrysogenum und Acremonium chrysogenum

[Transposons and the regulation of genetic expression in the antibiotic-producing fungi Penicillium chrysogenum and Acremonium chrysogenum]

2002. 119 Seiten, 21 Abbildungen, 10 Tabellen, 14x23cm, 280 g
Language: Deutsch

(Bibliotheca Mycologica, Band 195)

ISBN 978-3-443-59097-0, brosch., price: 42.00 €

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Keywords

Mykologie Transposon Transposase Protein Antibiotika Pilz Penicillium chrysogenum Acremonium chrysogenum

Contents

Inhaltsbeschreibung top ↑

In der vorliegenden Arbeit wurde die Aktivität des Transposons Restless aus T. inflatum in den ß-Lactam-Produzenten P. chrysogenum untersucht. Als Voraussetzung für eine Transposition des Restless Elementes in den Hyphenpilzen P. chrysogenum und A. chrysogenum erfolgte zudem die Analyse der korrekten Expression des Transposase-Gens in beiden Pilzen. Außerdem wurde ein Beitrag zur Untersuchung von Regulationsmechanismen der Cephalosporin-Biosynthese in A. chrysogenum geleistet. Mit den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen wurde Grundlagen für den Einsatz des Transposons Restless als molekulares Werkzeug in den ß-Lactam-Produzenten P. chrysogenum und A. chrysogenum geschaffen. Die Etablierung des "Transposon tagging"-Systems kann zur weiteren Aufklärung von Regulationsmechanismen der Antibiotika-Biosynthese beitragen. Das Verständnis dieser Mechanismen führt schließlich zur fortschreitenden Stammoptimierung und damit zur Steigerung der Antibiotika-Biosynthese.

Content Description top ↑

This work presents investigations of the activity of the transposon Restless from T. inflatum in the ß-lactam producing fungus P. chrysogenum. The correct expression of the transposase gene was analyzed as a necessary condition to use the filamentous fungi P. chrysogenum and A. chrysogenum for gene tagging with the Restless element. Additionally, the regulation of the cephalosporin C biosynthesis in A. chrysogenum was investigated. The results of this work provide the basic knowledge for the use of the transposon Restless as a tool for gene tagging in the ß-lactam producing fungi P. chrysogenum and A. chrysogenum. The development of the transposon tagging system may play an important role in elucidating the regulatory mechanisms of antibiotic biosynthesis. The knowledge of these mechanisms may finally serve to optimize strain improvement and therefore to increase the antibiotic biosynthesis.

Rev.: Mycological Research 107(4), April 2003 top ↑

The Restless transposon from Tolypocladium inflatum has been inserted into these two key fungi using a variety of vectors has been inserted into these two key fungi using a variety of vectors in order to facilitate its use for gene-tagging. The study explores ways to increase the activity of Restless, including triple transformation. The expression system used was based on the heterologous phoA-promoter in the Acremonium, polypeptides appearing necessary for the activity of the Restless element. Deletions of the transposon were identified by the selection of excision events investigated using sequence analysis, and may be mediated by a transposase protein. In addition, the promoter of the biosynthesis gene in the cephalosporin C producing A. chrysogenum was characterised by expression studies with a reporter gene, leading to the identification of regulatory sequences which enhance or repress expression. This study is important in providing a tool for gene-tagging in two ß-lactam producing fungi; this may assist in the elucidation of regulatory mechanisms for antibiotic synthesis and so strain enhancement. Sadly, this elegant study is marred by the strains of the two fungi used not being deposited in service genetic resource fungal collections.

Mycological Research 107(4), April 2003

Inhaltsverzeichnis top ↑


I. Einführung 1
1. Einleitung 1
2. Funktionelle Charakterisierung des Transposase-Proteins 3
2.1 Struktur des Proteins 3
2.2 DNA-Bindung der Transposase 5
3. Regulation der Transposition 8
3.1 Transkriptionelle Regulation der Transposase-Gen-Expression 8
3.2 Einfluss der Transposase-Konzentration auf die Transposition 10
3.3 Wirtsspezifische Faktoren 11
4. Ausblick 13
II. Problemstellung 17
III. Material und Methoden 20
1. Material 20
1.1 Stämme 20
1.2 Nährmedien 20
1.3 Plasmide 20
1.4 Oligonukleotide 22
1.5 Sonden 22
1.6 Chemikalien 23
1.7 Enzyme 23
1.8 Häufig verwendete Puffer 23
2. Methoden 24
2.1 Kulturbedingungen 24
2.2 Isolierung von Nukleinsäuren 24
2.3 Transformationen 25
2.4 Gelelektrophorese 26
2.5 Elution von DNA aus Agarosegelen 26
2.6 In vitro Rekombination von DNA 26
2.7 Southern Blots und DNA/DNA-Hybridisierungen 26
2.8 Radioaktive Markierung von DNA 27
2.9 Oligonukleotid-Synthese 27
2.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 27
2.11 DNA-Sequenzierung 29
2.12 Deletionen mit Exonuklease III / Nuklease S1 30
2.13 Auswertung von Nukleotidsequenzen 30
2.14 Selektion von Restless-Exzisionsereignissen nach Überexpression
des Transposase-Gens aus T. inflatum in P. chrysogenum 30
2.15 Quantitative Bestimmung der ?-Galaktosidase-Expression in
A. chrysogenum 31
2.16 Digitale Bildbearbeitung 31
2.17 Sicherheitsmaßnahmen 31
IV. Ergebnisse 32
1. Aktivität und Expression des Transposons Restless in
Penicillium chrysogenum 32
1.1 Transposonaktivität 32
1.1.1 Kotransformation von P. chrysogenum mit verschiedenen
Transposon-Vektoren und Analyse der Transformanten 34
1.1.2 Detektion putativer Exzisionsereignisse durch Selektion auf
Phleomycin-Resistenz 36
1.1.3 Molekularer Nachweis von Exzisionsereignissen 38
1.2 Überexpression des Transposase-Gens in P. chrysogenum 41
1.2.1 Konstruktion von Expressionsvektoren 41
1.2.2 Tripletransformation von P. chrysogenum und Analyse der
Transformanten 43
1.2.3 Transkriptionelle Expression des Transposase-Gens 45
1.2.4 Alternatives Spleißen des Transposase-Transkriptes 47
1.2.5 Aktivität des Transposons Restless nach Überexpression des
Transposase-Gens 49
1.3 Analyse der Transposon-Deletionen 53
2. Regulation der Genexpression in Acremonium chrysogenum 55
2.1 Transkriptionelle Expression des Transposase-Gens in
A. chrysogenum 56
2.2 Funktionsanalyse des cefEF-Promotors aus A. chrysogenum 58
2.2.1 Konstruktion von Vektoren zur Reportergenanalyse 58
2.2.2 Kotransformation von A. chrysogenum und Identifizierung
von Transformanten 60
2.2.3 Charakterisierung des cefEF-Promotors durch Analyse der
Reportergenexpression 62
V. Diskussion 65
1. Das Transposon Restless exzisiert in P. chrysogenum 66
1.1 Die Exzision des Transposons Restless in P. chrysogenum ist ein
sehr seltenes Ereignis 66
1.2 Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Faktoren auf die
Exzisionsrate des Transposons 69
1.3 Das exzisierte Restless Element erzeugt in P. chrysogenum einen
"footprint" 71
1.4 Das exzisierte Restless Element integriert nicht wieder ins Genom 74
2. Das Transposase-Gen des Restless Elementes wird in P. chrysogenum
exprimiert 76
2.1 Eine gleichzeitige Transformation von drei verschiedenen Vektoren
ist in P. chrysogenum möglich 77
2.2 Das Transposase-Gen wird in P. chrysogenum und A. chrysogenum
transkribiert 78
2.3 In P. chrysogenum findet eine korrekte, jedoch nicht vollständige
Prozessierung des Restless-Transkriptes statt 79
2.4 Heterologe Genexpression auf der Basis des phoA-Promotors ist in
P. chrysogenum und A. chrysogenum möglich 81
2.5 Beide vom Transposase-Gen kodierten Proteine sind für die
Transposon-Aktivität notwendig 83
2.6 Die Überexpression des Transposase-Gens zeigt keinen Einfluss
auf die Aktivität des Restless Elementes 86
3. Rekombinationen zwischen direkten Sequenzwiederholungen erzeugen
Deletionen im Restless Element 88
4. Durch Deletionsanalysen des cefEF-Promotors aus A. chrysogenum werden
regulatorisch wirksame Sequenzbereiche identifiziert 90
VI. Zusammenfassung 95
VII. Summary 98
VIII. Literatur 100
IX. Anhang 119