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Werner Howad:

Gewebespezifische mitochondriale RNA-Prozessierung bei der Hirse Sorghum bicolor

[Tissue specific RNA editing in millet (Sorghum bicolor)]

1999. 1. Auflage, 115 Seiten, 25 Abbildungen, 9 Tabellen, 14x22cm, 280 g
Language: Deutsch

(Dissertationes Botanicae, Band 300)

ISBN 978-3-443-64212-9, brosch., price: 36.00 €

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Contents

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1 Einführung 1

1.1 Einleitung

1.2 RNA-Edierung bei höheren Pflanzen 2
1.2.1 RNA-Edierung plastidärer Transkripte 2
1.2.2 RNA-Edierung mitochondrialer Transkripte 3
1.3 Zytoplasmatisch männliche Sterilität (CMS) bei höheren Pflanzen 5
1.3.1 CMS bei Zea mays mit T Zytoplasma (cms-T) 8
1.3.1.1 Das cms-T-Zytoplasma enthält den offenen Leserahmen T-urfl3 und
verleiht eine Sensitivität gegen T-Toxine 8
1.3.1.2 Auslösung von CMS und Toxin-Sensitivität durch T-urfl3 9

1.3.1.3 Restauration der Fertilität durch Rf1 und Rf2 10
1.3.2 CMS bei Sorghum bicolor 11
2 Problemstellung 14
3 Material und Methoden 16
3. Material 16
3.1.1 Linien und Stämme 16

3. 1.1.1 Linien der Hirse Sorghum bicolor 16

3.1.1.2 Linien des Weizens Triticum 16
3.1.1.3 Escherichia coli Stamm 17
3.1.2 Oligonukleotide 17

3.1.3 Plasmide 18
3.1.4 Membranen und Papiere 19
3.1.5 Chemikalien l9
3.1.6 Enzyme und Inhibitoren l9
3.1.7 Häufig verwendete Lösungen, Puffer und Medien 20
3.2 Methoden 20
3.2.1 Kulturbedingungen 20
3.2.1. Escherichia coli 20
3.2.1.2 Sorghum bicolor, Triticum 20
3.2.2 Isolierung von Nukleinsäuren 20
3.2.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli 20
3.2.2.2 Isolierung von Gesamt-DNA und -RNA aus Koleoptilen von Sorghum bicolor 21

3.2.2.3 Isolierung von RNA aus Antheren von Sorghum bicolor und Triticum 21

3.2.2.3.1 Isolierung von mtRNA aus Antheren 21
3.2.2.3.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus Pollen und somatischem Antherengewebe 21

3.2.3 Hydrolyse von DNA 22
3.2.4 Gelelektrophorese 22

3.2.4.1 Agarosegele 22

3.2.4.2 Polyacrylamidgele 22
3.2.5 Elution von DNA aus Agarosegelen 22
3.2.6 Northern Blot und RNA/DNA Hybridisierungen 23


3.2.7 Radioaktive Markierung von Nukleinsäuren 23
3.2.8 DNA-Sequenzierung 23
3.2.9 Reverse Transkription 23
3.2.10 Polymerase-Kettemeaktion (PCR) 24
3.2.11 «Nested» Polymerase Kettenreaktion («Nested»-PCR) 24

3.2.12 Asymmetrische Polymerase Kettenreaktion 24
3.2.13 Quantitative PCR 24
3.2.14 Starterverlängerungs-Experimente («Primer Extension») 25

3.2.15 Herstellung eines T-Vektors 25
3.2.16 Klonieren in Plasmide 25
3.2.17 Oligonukleotidsynthese 25
3.2.18 Auswertung von Nukleotid-Sequenzen 25
3.2.19 Photodensidometrische Ermittlung und Berechnung der RNA-Edierung 26
3.2.20 Sicherheitsmaßnahmen 26
4 Ergebnisse 27
4.1 Fertilität verschiedener Hirselinien 27
4.2 Vergleichende Untersuchung der RNA-Edierung einzelner Transkripte aus
Antheren und Koleoptilen von S. bicolor 29
4.2.1 Reverse Transkription und Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) verschiedener Transkripte aus Antheren und Koleoptilen 29

4.2.2 Die atp6 Transkripte werden gewebespezifisch ediert 31
4.2.2.1 Photodensidometrische Auswertung 32
4.2.2.2 Sequenzierung klonierter cDNA des atp6-2 Transkriptes 36
4.2.2.3 Die atp6 RNA-Edierung in Antheren korreliert mit der Fertilität der Linie F2 39
4.2.3 Die atp9 und nad4 RNA-Edierung zeigt keine linien- oder gewebespezifische Unterschiede 41

4.2.4 Die RNA-Edierung des orfl O7 Transkriptes verläuft linienspezifisch 42
4.2.5 Die Einzeltranskriptbereiche der nad3 und rpsl 2 Gene werden stärker
ediert als das Kotranskript 45
4.2.6 Plastidäre Transkripte werden nicht gewebe- oder linienspezifisch ediert 48
4.3 Charakterisierung der gewebespezifischen Reduzierung der atp6 RNA-Edierung bei S.bicolor 49

4.3.1 Die Transkripthäufigkeit nimmt keinen Einfluß auf die atp6 RNA-
Edierung 49
4.3.2 In Pollen und somatischem Antherengewebe liegt eine Reduzierung der
atp6 RNA-Edierung vor 51
4.3.3 Einfluß der Rf Gene auf die atp6 RNA-Edierung in Antheren 53
4.4 Das atp6 Transkript wird in Antheren fertiler und steriler Weizenlinien
vollständig ediert 55
5 Diskussion 57
5.1 Einfluß der RNA-Edierung auf die CMS und die Transkript-Prozessierung 57
5.1.1 Kann eine in Antheren reduzierte atp6 RNA-Edierung CMS auslösen? 58
5.1.1.1 In Abhängigkeit vom j eweiligen Kernhintergrund besteht eine
Korrelation zwischen der atp6 RNA-Edierlmg in Antheren und
der Fertilität 60
5.1.1.2 Die transkriptspezifische Reduzierung der atp6 RNA-Edierung
in Antheren ist möglicherweise auf eine Inhibierung der beteiligten cis- und trans-Faktoren zurückzuführen 62

5.1.2 Die Transkript-Prozessierung des orflO7 ist abhängig von der RNA-
Edierung und korreliert mit der atp6 RNA-Edierung in Antheren 65
5.1.3 Die Auslösung der CMS in Weizen und Hirse ist auf verschiedene
Ursachen zurückzuführen 69

5.1.4 Der Unterschied der RNA-Edierung in Einzel- und Kotranskriptbereichen der nad3 und rps12 Gene deuten auf eine Kotranskript-Prozessierung hin 70

5.2 Das CMS-Phänomen der Hirse mit IS1112C Zytoplasma weist Gemeinsamkeiten
mit dem CMS-Phänomen beim Mais mit T-Zytoplasma auf 72
5.2.1 Die Transkript-Prozessierungen der Chimären Gene orflO7 und T-urfl3
korrelieren mit der Wiederherstellung der Fertilität 72
5.2.2 Die Gewebespezifität wird wahrscheinlich durch antherenspezifische
Faktoren hervorgerufen 74
5.3 Modell der Fertilitätsrestauration durch die Rf Gene in den verschiedenen
Hirselinien 75
5.3.1 Sterilität der Linien A3Tx398 und A3Tx7000 76
5.3.2 Fertilität der Linien IS 111 2C, Tx398 und Tx7000 78
5.3.3 Partielle bis vollständige Fertilität der Linien Fl und F2 81

6 Zusammenfassung 85
7 Referenzen 88
8 Anhang 105