I. Theoretischer Teil:
Physiologie und Genetik der alternativen Atmung in niederen Eukaryonten
1. Die aerobe Ahnung 1
2. Allernative Respiration 3
3. Physiologische Charakteristika der alternativen Atmung 4
3.1. Lokalisation 5
3.2. Verzweigungspunkt 5
4. Regulation 6
5. Genetik 8
6. Enzymatische Grundlagen der alternativen Atmung 9
7. Energiekonservierung oder Uberlaufstoffwechsel? 11
8. Mögliche biologische Bedeutungen 13
8.1. Thermogenese 13
8.2. Resistenz gegen Atemgifte 13
8.3. Chronobiologie 14
8.4. Verminderung des Sauerstoffpartialdruckes 15
8.5. Freie Radikale 15
8.5.1. Schädigungen durch freie Radikale 18
8.5.2. Differenzierungsvorgänge 19
9. Evolutionsbiologie 19
10. Anwendungsaspekte 20
11. Schlußfolgerungen 21
II. Praktischer Teil:
Die molekularbiologische Analyse der physiologischen Phänomene
des Seneszenzsyndroms bei dem Ascomyceten Podospora ar~serirza
1. Problemstellung 23
1.1. Alterung 24
1.2. Seneszenz bei Podospora 26
1.2.1. Phenoloxidasen 26
1.2.1.1 Lactase 26
1 .2.2. Mitochondrien 27
1.2.3. Kohlenhydratverwertung 29
1.2.4. Altenative Atmung 30
1.2.5. OxidativerStreß 30
1.2.5.1. Ermittlung des OSS 31
1.3. Lösungsansätze 32
1.3.1 . Netzplan 33
2. Material und Methoden 34
2.1. Stämme 34
2.2. Nährmedien 34
2.3. Puffer und Lösungen 34
2.4. Chemikalien und Geräte 35
2.5. Kultivierungsbedingungen 35
2.5.1. Glukosebestimmung 35
2.6. Lactase-Assay 35
2.7. Proteinbestimmung 35
2.8. Polyacrylamidgelelektrophorese zur Proteintrennung 35
2.9. Mitochondrienpräparation 36
2.9.1. Subfraktionierung von Mitochondrien 36
2.10. Atmungsmessungen 36
2.11. Photometrische Bestimmungen der Redoxpaare 37
2.12. Quantifizierung der intrazellularen antioxidativen Systeme 37
2.12.1. Superoxiddismutase 37
2.12.2. Katalase 37
2.12.3. Glutathionreduktase 3B
2.12.4. Glutathionperoxidase 38
2.12.5. Glutathion und Glutathiondisulfid 3X
2.12.. Ascorbinsäure 39
2.12.7. alpha-Tocopherol 39
2.13. Assay der Lipidperoxidation 39
2.14. Chemilumineszenz zur Bestimmung aktivierter Sauerstoffspezies 40
2.14.1. Meßprinzip 40
2.14.2. Quencheffekt durch Melaninpigmente 40
2.14.3. Meßprotokoll 41
2.15. Elektronenspinresonanz inorganello und in vivo 41
2.15.1. Prinzip der Elektronenresonanz-Spektroskopie 41
2.15.2. Aufbau eines Elektronenresonanz-Spektrometers 43
2.15.3. Messungen mit der Flachzelle im X-Bandbereich 45
3. Ergebnisse 46
3.1. Lactase 46
3.2. Katabolitrepression 46
3.3. Atmungsstoffwechsel 49
3.3.1. Lactase und alternative Atmung 51
3.3.1.1. Laccasesubstrate der Atmungskette 55
3.3.1.2. Laccaseaktivität im Verlauf der Alterung 56
3.3.1.3. Lokalisation der Lactase 57
3.3.1.4. Lactase als alternative Oxidase? 58
3.4. Pro- und Antioxidantien und ihr Einfluß auf die Lebensdauer 58
3.5. Oxidativer Streß-Status 60
3.5.1. Enzymatische intrazellulare Antioxidantien 60
3.5.1.1. Superoxiddismutase 60
3.5.1.2. Katalase 61
3.5.1.3. Glutathionreduktase 62
3.5.1.4. Glutathionperoxidase 63
3.5.2. Nichtenzymatische intrazellulare Antioxidantien 65
3.5.2.1. Glutathion/Glutathiondisulfid 65
3.5.2.2. Ascorbinsäure 66
3.5.2.3. or-Tocopherol 68
3.5.3. Lipidperoxidation 70
3.5.4. Aktivierte Sauerstoffspezies 71
3.5.5. Radikalnachweis mittels Elektronenspinresonanz 76
3.5.5.1. Freie Radikale inorganello 80
3.5.5.2. Freie Radikale in vivo 83
3.5.5.3. Wirkungsnachweis für Antioxidantien 84
4. Diskussion 86
4.1. ATP-Gewinnung und Lebensdauer 86
4.2. Oxidativer Streß 80
4.3 Freie Radikale in Podospora
4.3 1. Indirekte Nachwelse für freie Radikale 90
4.3.2. Direkte Bestimmungen freier Radikale
4.4. Alterungshypothese 96
5. Zusammenfassung 101
6. Literaturverzeichnis 102
7. Anhang 117