1. Einleitung 1
1.1 Einführung 1
1.2 Struktur und Verbreitung der ß-Lactam Antibiotika 2
1.3 Biosynthese von ß-Lactam Antibiotika 4
1.3.1 Die erste Stufe der ß-Lactam Biosynthese: Bildung von
Isopenicillin N 4
1.3.2 Die zweite Stufe der ß-Lactam Biosynthese:Bildung verschiedener
Endprodukte 5
1.4 Organisation der ß-Lactam Gene 8
1.5 Evolution der ß-Lactam Biosynthese 9
1.6 Physiologie der ß-Lactam Biosynthese in Hyphennilzen 9
1.6.1 Einfluß von Glukose 10
1.6.2 Einfluß des pH-Wertes 11
1.6.3 Beeinflussung durch Stickstoff und Aminosäuren 12
1.6.4 Einfluß des Sauerstoffgehaltes 13
1.6.5 Regulation durch Kompartimentierung 13
1.7 Genetische Manipulation von Hyphenpilzen 14
1.8 cis-Elemente und trans-Faktoren 15
1.9 Ausblick 16
2. Problemstellung 18
3. Material und Methoden 21
3.1 Material 21
3.1.1 Organismen 21
3.1.2 Delta-Phagen 22
3.1.3 Medien 22
3.1.4 Plasmide 23
3.1.5 Oligonukleotide 24
3.1.6 Chemikalien 24
3.1.7 Enzyme 25
3.1.8 Häufig verwendete Puffer und Lösungen 25
3.2 Methoden 26
3.2.1 Kulturbedingungen 26
3.2.2 Transformationen 26
3.2.3 Isolierung von Nukleinsäuren 27
3.2.4 Gelelektrophorese 28
3.2.5 Southern-Blotting und DNA-DNA-Hybridisierungen 28
3.2.6 Northern-Blotting und DNA-RNA-Hybridisierungen 29
3.2.7 Radioaktive Markierung von DNA 29
3.2.8 RNAse-Schutzexperimente 29
3.2.8.1 In vitro Transkription 29
3.2.8.2 Hybridisierung und RNAse-Behandlung 29
3.2.9 Starterverlängerungs-Experimente (primer extension) 30
3.2.10 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 30
3.2.11 Gerichtete Verkürzung mit dem Exonuklease III/NukleaseSI-System 30
3.2.12 DNA-Sequenzierung 30
3.2.13 Synthese von Oligonukleotiden 31
3.2.14 In vitro Rekombination von DNA 31
3.2.15 Quantitative Bestimmung der ß-Galaktosidase-Expression 31
3.2.16 Nachweis von Expandase/Hydroxylase durch Immunoblotting 32
3.2.16.1 Uberexpression eines Proteinfragmentes 32
3.2.16.2 Proteinisolierung und Ni - -NTA Affiitätschromatographie 32
3.2.17 Herstellung eines polyklonalen Antiserums 32
3.2.17.1 Western-Blotting und Behandlung mit Pegodat 32
3.2.17.2 Immunodetektion 33
3.2.18 Bestimmung von Proteinkonzentrationen 33
3.2.19 Sicherheitsbestimmungen 33
4. Ergebnisse 34
4.1 Charakterisierung des ceJEF/cef Genbereiches und eines Antiserums
gegen die DAOCS/DACS 34
4.1.1 Charakterisierung des ceJEF/cef Genbereiches 34
4.1.2 Herstellung eines polyklonalen Antiserums mit einem Proteinfragment
der DAOCS/DACS 36
4.1.3. Charakterisierung des Antiserums 40
4.2 Molekulare Physiologie der Expression von ceJEF und ce/G 43
4.2.1 Einfluß des pH-Wertes auf die Expression von ceJEF und cefG 44
4.2.2 Einfluß von L-Lysin und L-Methionin auf die Expression von
cefEF und cefG 48
4.3 Molekulare Genetik von cefEF 5 1
4.3.1 Charakterisierung der 5'-Enden des cefEF Transkriptes 51
4.3.2 Reportergenanalyse des ceJEF-Promotors 55
4.3.2.1 Herstellung der Promotor-Reportergenfusionen 56
4.3.2.2 Deletion des cefEF-Promotorbereiches 58
Identifizierung von geeignete Transformanten 60
4.3.2.4 Charakterisierung des cetEF-Promotors durch
quantitative Reportergenmessungen 62
5.Diskussion 65
5.1 Immunologischer Nachweis der DAOCS/DACS in Acremonium chrysogenum 65
5.1. l Expression eines Proteinfragmentes in Escherichia coli und Ni~-
Affinitätsreinigung 65
5.1.2 Der immunologische Nachweis zeigt die Korrelation der Protein-
menge von DAOCS/DACS mit der Produktivität für Cephalosporin C in
Acremonium chrTsogenum 69
5.1.3 Liegt die DAOCS/DACS in Acremonium chrysogenum glykosyliert vor? 70
5.2 Molekulare Physiologie der Cephalosporin C Biosynthese 71
5.2.1 Der pH-Wert zeigt keinen Einfluß auf die Expression von ceJEF
und ceJO 71
5.2.2 L-Methionin hemmt die Expression von Cephalosporin C in dem
Stamm ATCC 14553, aber nicht in dem Stamm A3/2 73
5.2.3 L-Lysin steigert die Expression des cefEF Gens in dem Stamm A3/2 76
5.2.4 Die Regulation der DAOCS/DACS in Acremonium chrysogenum erfolgt
bereits auf der Transkript Ebene 78
5.3 Molekulare Analyse des putativen ceJEF-Promotors 80
5.3.1 Das ceJEF-Gen besitzt mehrere putative Startpunkte Dur die
Transkription 80
5.3.2 Verwendung der ß-Galaktosidase aus Escherichia coli als Reporterenzym zur
Charakterisierung des ceJEF-Promotors in Acremonium chrysogenum 83
5.3.3 Die Expression des Reportergens (lacZ) wird durch die ektopische
Integration beeinflußt 85
5.3.4 Der cefEF-Promotor enthält Bereiche mit putativen positiven und
negativen cis-wirksamen Elementen 87
6. Zusammenfassung 92
7. Literatur 94
8. Anhang 115