Struktur, Funktion und Spleißprozesse mitochondrialer Introne
Das "mobile Intron" des Ascomyceten Podospora anserina
Teil I: Die Introne mitochondrialer Mosaikgene niederer Eukarvonten
1. Einleitung 1
2. Struktur mitochondrialer Introne 3
2.1. Introne der Gruppe I 4
2.2. Introne der Gruppe II 15
3. Spleißprozesse mit ochondrialer Introne in vitro 18
3.1. Autokatalytisches Spleißen von Gruppe I Intronen 18
3.2. Autokatalytisches Spleißen von Gruppe II Intronen 25
4. Spleißprozesse mitochondrialer Introne in vivo 30
4.1. Intron-kodierte Spleißproteine (Maturasen) 32
4.2. Kern-kodierte Spleißproteine 39
5. Sonstige Intron-kodierte Funktionen 43
Teil II: Die Transkngte aus der mtDNA Re~p des. "mobilen Introns"
des Ascomvceten Podosnora anserina
1. Problemstellung 46
2. Material und Methoden 50
2.1. Stärume 50
2.2. Nährmedien, Kulturbedingungen und Stammhaltung 50
2.3. Plasmide 50
2.4. Wichtige Reagenzien und Chernikalien 51
2.5. Wichtige Puffer und Lösungen 52
2.6. DNA-Isolation aus E. coli 52
2.6.1. Schnellaufarbeitung 52
2.6.2. Plasmid-Isolation 52
2.7. Isolation von DNA und RNA aus P. anserina 53
2.7.1. Isolation mitochondrialer DNA 53
2.7.2. Isolation mitochondrialer RNA 53
2.8. Restriktion von DNA 54
2.9. Denaturierung einzelsträngiger Nukleinsäuren
zur Gelelek:trophorese 54
2.9.1. RNA-Denaturierungfiir die Agarose-Gel-Elektrophorese 54
2.9.2. Denaturierung von Nukleinsäuren für die
Polyacrylamid/Harnstoff-Gelelektrophorese 54
2.10. Gelelektrophorese 54
2.10.1. Elektrophorese mit Agarose-Gelen 54
2.10.2. Elektrophorese mit Polyacrylamid(PAA)-Gelen 55
2.11. Elution von Nukleinsäuren aus Gelen 55
2.11.1. Elution von DNA aus Agarose-Gelen 55
2.11.2. Elution von RNA aus "low-melting-temperature"(LMT)
Agarose-Gelen 56
2.11.3. Elution von DNA aus Polyacrylamid(PAA)-Gelen 56
2.12. Radioaktive Markierung von Nukleinsäuren mit 32p 56
2.12.1. Mck-Translation von DNA mit alpha32P-dATP 56
2.12.2. 3'-Endmarkierung von DNA mit DNA-Polymerase I
(Klenow-Fragment) und y32P-ATP 56
2.12.3. 5'-Endmarkierung von DNA mit T4 Polynukleotid-Kinase
und y,32p ATp 56
2.12.4. 5'-Endmarkierung von RNA mit T4 Polynukleotid-Kinase
und y32P-ATP 57
2.13. Hybridisierung von Nukleinsäuren 57
2.13.1. Filterhybridisierung von DNA 57
2.13.2. Filterhybridisierung von RNA 57
2.14. in vitro Rekombination von DNA 57
2.14.1. Ligation 57
2.14.2. Alkalische Phosphatase Behandlung 58
2.14.3. "blunt end" Reaktion mit T4 DNA-Polymerase 58
2.14.4. Transformation 58
2.15. Strukturanalyse von RNA 58
2.15.1. Elektronenmikroskopie 58
2.15.2. RNaseH Verdauung 59
2.15.3. "debranching assay" mit HeLa Zellextrakt 59
2.15.4. "primer extension" und Didesoxy-Sequenzierung 59
2.16. in vitro Transkription 59
2.17. Spleißen von RNA in vitro 60
2.18. Biologische Sicherheitsmaßnahmen 60
3. Ergebnis: 61
3.1. Häufigkeitsverteilung mitochondrialer RNA über das
Chondriom des Wildstammes s von P. anserina 61
3.2. Die Transkripte der diskontinuierlichen Gene COI und Cytb
des Wildstamrnes s von P. anserina 62
3.2.1. Klonierung von mtDNA Fragrnenten für die
Transkriptkartierung 64
3.2.2. Kartierung der Transkripte 64
3.3. Ursprung der zum "mobilen Intron" homologen Transkripte 69
3.3.1. Vergleich der Transkripte des "mobilen Introns" verschiedener
Podospora-Stämme 69
3.3.2. Strangspezifität der beiden Transkripte des "mobilen Introns" 71
3.4. Feinkartierung der Transkripte des ersten Exons (E1), des ersten
Introns (I1/plDNA) und des zweiten Exons (E2) des COI Gens 73
3.4.1. Isolierung und Charakterisierung von Exon 1- und Exon
2-spezifischen DNA Fragmenten 74
3.4.2. Kartierung der Transkripte 75
3.5. Strukturanalyse der Transkripte des "mobilen Introns" 76
3.5.1. Elektronenmikroskopie 77
3.5.2. RNaseH Verdanung 78
3.5.3. "debranching assay" mit HeLa Zellextrakt 79
3.5.4. "primer extension" und Didesoxy-Sequenzierung 80
3.6. Spleißprozesse des COI I1 in vitro 81
3.6.1. Konstruktion von Transkriptionsplasmiden mit der
E1/11/E2 Region des COI Gens 81
3.6.2. invitroSpleißreaktion der COII1 RNA 83
4. Diskussion 85
4.1. Die reifen mRNAs der Mosaikgene COI und Cyth 85
4.2. Die Transkripte des "mobilen Introns" von P. anserina 91
4.2.1. Ursprung der Spezies B RNA (2,7 kb) 91
4.2.2. Ursprung der Spezies A RNA (2,5 kb) 92
4.2.3. Die Transkripte als Grundlage für eine revene Transkription
des "mobilen Introns" 95
4.2.4. Die Transkripte als Grundlage für eine Expression des
"mobilen Introns" 96
4.3. in vitro Spleißreaktion der COI I1 RNA 99
5. Zusammenfassung 101
6. Literaturverzeichnis 102