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In der vorliegenden Arbeit wird die Herstellung und Charakterisierung
von linearen Hybridplasmiden auf der Basis der linearen Killerplasmide
aus Kluyveromyces lactis vorgestellt. Zusammengefaßt liefern
die Untersuchungen folgende Ergebnisse:
1. Das lineare Plasmid pGKLl kann durch In vivo-Rekombinationsprozesse
verändert werden. Transformierte Fremd-DNA wird in das Plasmid gezielt
integriert oder gegen Plasmidbereiche ausgetauscht.
2. Die Insertion eines Kern-Gens, des LEU2-Gens aus Saccharomyces
cerevisiae, in das Plasmid pGKLl führt zu linearen Hybridplasmiden,
die anstelle der terminalen Proteine des nativen Plasmids typische
Hefe-Telomerstrukturen an den Enden besitzen. Das LEU2-Gen kann auf
dem zytoplasmatisch lokalisierten Plasmid nicht exprimiert werden;
erst das Anheften von Telomeren und die daraus resultierende nukleäre
Lokalisation erlaubt eine Expression des Gens.
3. Die Insertion des LEU2-Gens, versehen mit den Promotor- und
Terminator-Bereichen des Killertoxin-Gens von pGKLl, führt zu einem
linearen Hybridplasmid (pJKLl), das alle Struktur-Elemente und
Eigenschaften der nativen linearen Plasmide besitzt. Die 5'-Enden der
terminalen, invers repetitiven DNA-Sequenzen von pJKLl sind durch
Proteine blockiert, das Plasmid ist im Zytoplasma lokalisiert und
besitzt eine mit pGKLl vergleichbare hohe Stabilität und Kopiezahl.
4. Das LEU2-Gen von pJKLl wird von dem für die Fusion verwendeten
Killertoxin-Promotor aus transkribiert. Auf von pGKLl abgeleiteten
Hybridplasmiden werden weder der Promotor noch der Terminator des
Kern-LEU2-Gens erkannt. Die Ergebnisse sind ein Beweis für ein
eigenständiges Transkriptionssystem der Killerplasmide.
5. Das Plasmid pJKLl kann als Protein-DNA-Komplex in Saccharomyces
cerevisiae transformiert werden.
Mit der Konstruktion des Plasmids pJKLi ist es erstmalig gelungen,
Fremd-DNA in ein lineares Plasmid einzufügen und gleichzeitig dessen
native Struktur zu erhalten. Wegen ihrer hohen Kopiezahl, der hohen
Stabilität und wegen ihres eigenständigen Transkriptions-Systems
stellen diese linearen Hybridplasmide generell eine Alternative zu den
zirkulären Hefevektoren dar.
Die Vorgehensweise, lineare Plasmide gezielt zu verändern, eröffnet
zudem Möglichkeiten, die Plasmide bezüglich ihrer Gen-Funktion und
Regulation zu charakterisieren.