Ziel der vorliegenden ökophysiologischen Studien war, Informationen über den Zusammenhang von Wasserhaushalt (insbesondere unter Wasserstreßbedingungen) und Sporulation eines weichfleischig fruktifizierenden Basidiomyceten zu gewinnen. Als Untersuchungsobjekte wurden zwei Vertreter der Gattung Pleurotus, P. ostreatus und P. pulmonarius, gewählt, da sie zum einen in Mitteleuropa als "saisondimorphe" Arten heimisch sind, zum anderen — insbesondere P. ostreatus — als aggressive Holzzersetzer, gleichzeitig aber auch als großtechnisch kultivierte Speisepilze Praxisrelevanz aufweisen.
l. Ausgangs- und steter Anhaltspunkt der Arbeit war das Sporulationsverhalten des (weiter verbreiteten) Winterpilzes P. ostreatus in Korrelation mit dem Klimaverlauf am natürlichen Standort.
Hinsichtlich einer " Langzeittendenz" (Wochen- bis Monatszeiträume) wirken hier Temperatur- und Wasserfaktor ausschlaggebend auf die Sporulation ein, allerdings in jahreszeitlich unterschiedlicher Gewichtung:
- Insbesondere im Winter bei niedrigen Temperaturen bis wenig über dem Gefrierpunkt ist die Temperatur die entscheidende Variable: Ein Anstieg der mittleren Temperatur erhöht die Sporentagessummen bzw. ermöglicht nach härterem Frost eine Wiederaufnahme der Sporulation, die unter etwa -2,5°C eingestellt wird. Tage- bis wochenlangen Frost (bis mindestens -16°C) können P. ostreatus-Fruchtkörper unter bestimmten Voraussetzungen überstehen und nach dem Auftauen erneut sporulieren.
— Bei durchwegs milderen Temperaturen über dem Gefrierpunkt bestimmt dagegen der Faktor Wasser den Sporulationsverlauf: Nur regelmäßige Niederschläge (Regen und bedingt Tau; hohe relative Luftfeuchte allein ist hingegen unwirksam) erlauben in diesem Fall einem Fruchtkörper eine einigermaßen kontinuierliche Sporulation. Die längste im Gelände beobachtete Sporulationsperiode eines einzelnen Fruchtkörpers betrug ca. vier Monate. Als Voraussetzung für solche Langlebigkeit eines weichfleischigen Winterpilzes müssen beträchtliche Trocken- wie Frosttoleranz angenommen werden.
Im Sporulationstagesgang ist keine endogene Rhythmik festzustellen.
Temperatur und Sporulationsintensität sind im Tagesgang nur dann positiv korreliert, wenn Plus- und Minustemperaturen abwechseln. Bei durchwegs milderen Temperaturen bedingt dagegen der Temperaturanstieg untertags einen teilweise drastischen Rückgang der relativen Luftfeuchte - verbunden mit einem steilen Sporulationsabfall: Im Tagesgang spielt also die relative Luftfeuchte die entscheidende Rolle.
Vor dem Hintergrund dieser Freilanddaten erfolgten unter geregelten Laborbedingungen die weiteren Untersuchungen:
2. Zum Sporulationsverlauf von P. ostreatus- und P. pulmonarius-Kulturfruchtkörpern in Abhängigkeit von einzelnen wie kombinierten Klimafaktoren
- Verschiedene Klimareize (Temperatur-‚ Feuchte- und Licht/Dunkel-Wechsel) - einzeln oder in Kombination - wurden von beiden Pleurotus-Arten in grundsätzlich gleicher Weise beantwortet.
— Entsprechend den Hinweisen aus den Geländedaten, läßt sich endogene (z.B. circa-diane) Rhythmik mit Sicherheit ausschließen.
- Während sich die grundsätzliche Bedeutung ausreichender relativer Luftfeuchte für die Sporulationsdauer eines Fruchtkörpers bestätigte, zeigte im Laborexperiment ein Feuchtewechsel - völlig im Gegensatz zu den Freilandbefunden - keine eindeutige Wirkung auf die Sporulationsintensität.
— Die Temperatur dagegen ist in nicht extremen Bereichen (zwischen 8 und 22°C) eindeutig positiv mit der Sporulationsintensität korreliert; ein T-Anstieg wird dabei typischerweise mit einer "überschießenden" ("phasischen") Reaktion beantwortet.
— Überraschenderweise stellte sich (im Labor!) das Licht als regelrechter "Sporulationskiller" heraus: Sehr häufig war der Sporulationsverlauf bei Licht/Dunkel-Wechsel als "Alles-oder-Nichts-Reaktion" zu charakterisieren.
3. Untersuchungen zum Schwerpunkt 'Wasserfaktor'
3.1. Zu den Wasserverhältnissen im Fruchtkörper allgemein
Eine im wesentlichen gravimetrische Erfassung des Wasserabgabe-‚ Wasseraufnahme- und Wasserleitungsverhaltens verdeutlichte eindrücklich den Poikilohydren-Status von Pleurotus. Transpirationsschutz im Sinne Höherer Pflanzen existiert nicht: So klassifizierten exakte Wasserpermeabilitätsmessungen die Hutdeckschicht von Pleurotus (und einer Reihe weiterer Basidiomyceten) als ebenso " effektive" Wasser"barriere" wie Schreibpapier. Insofern läßt sich streng genommen von Was- ser"haushalt" schwerlich sprechen: Die bestimmenden Phänomene sind rein physikalischer Natur (etwa Evaporation, Quellung und Diffusion).
- Entsprechend der Evaporation eines gleichgestalteten wasserdurchtränkten physikalischen Körpers ist demnach die eines Pleurotus-Sporokarps (neben ihrer Abhängigkeit von klimatischen Variablen) umso intensiver, je größer sein Oberflächen/Volumen- Verhältnis ist. Daher setzt büschelförmiges (verglichen mit solitärem) Wachstum als "passiver" Verdunstungsschutz die Evaporationsgeschwindigkeit der Pleurotus-Fruchtkörper ganz erheblich herab; bei gravierenderer Austrocknung "halten" speziell die Lamellen durch Wellung und Schrägstellung Restwasser verhältnismäßig lang fest.
— Was die Wasseraufnahme und -weiterleitung betrifft, gelten auch hier vorwiegend physikalische Gesetze: So kann über die relativ großflächige Hutdeckschicht verfügbares Wasser wesentlich effizienter absorbiert werden als über den Stielquerschnitt. Den räumlich-zeitlichen Verlauf der Wasserweiterleitung im Sporokarp bestimmen - abgesehen von den Klimavariablen - hauptsächlich dessen Morphologie und vor allem Anatomie (Hyphentextur!).
- Von Interesse ist der Fruchtkörper-Wasserhaushalt insbesondere im Zusammenhang mit dem Phänomen des sogenannten “Wiederauflebens” allgemein. Während evaporierende Pleurotus-Fruchtkörper gelegentlich erst unterhalb eines Restwassergehalts von 26% des Trockengewichts die Sporulation einstellten, sind für eine Sporulationswiederaufnahme i.d.R. mindestens 300% des Trockengewichts erforderlich. Da ein ausgetrockneter Fruchtkörper durch ausschließliche Aufnahme von Wasserdampf maximal nur etwa 45% seiner Trockenmasse an Wasser zu absorbieren vermag, ist die Verfügbarkeit von tropfbar flüssigem Wasser Voraussetzung für ein "revival", welches im Schnitt bereits 4—5 Stunden später erfolgen kann.
3.2. Zur Auswirkung von Wasserdefizit (Trocken-‚ Frost- und Osmostreß) auf Zustand und Funktion eines Fruchtkörpers
Taupunktpsychrometrie erwies sich zur Bestimmung des Wasser— und des osmotischen Potentials verschiedener Teile frischer oder nach Trocknis wiederaufgequollener P. Ostreatus-Fruchtkörper als prinzipiell problematisch. Eindeutig allerdings errechneten sich für das Hymenophor gequollener Sporokarpe "grundsätzlich positive, teilweise recht hohe (Mindest-)Turgorpotentiale‚ was wohl als Hinweis für die Vitalität zumindest eines Teils der Basidien — und damit indirekt für Trockentoleranz - gewertet werden darf.
Die rasterelektronenmikroskopische Untersuchung frischer, (monatelang) lufttrockkener sowie wiederaufgequollener P. Ostreatus-Fruchtkörper, die teilweise Frost unterschiedlicher Dauer und Intensität ausgesetzt wurden, demonstrierte wiederum erstaunliche Trocken- und zusätzlich Frosttoleranzeigenschaften der Sporokarpe. Selbst die "härteste"- Frostbehandlung (28 h -20°C) wurde von einem Teil der sterilen Hyphen resp. Hymenialelemente immer überlebt: So wirkten etwa - insbesondere im frischen Fruchtkörper - die vollplasmatischen jüngeren Basidien i.d.R. wenig beeinträchtigt; damit wäre beispielsweise bei winterlichen Wärmeeinbrüchen eine rasche Sporulationswiederaufnahme möglich.
In Vitalitätstests mittels Fluoresceindiacetat zeigten künstlich eingefrorene Proben von P. ostreatus-Kulturfruchtkörpern eine zwar eindeutige, aber nur mäßig intensive "Vitalfluoreszenz". Ein während Dauerfrost direkt nach Entnahme vom Standort präpariertes Freiland-Sporokarp hingegen bestand in sämtlichen Teilen weitestgehend aus lebenden Hyphen bzw. Hymenialelementen und bewies damit seine "Eignung" als "Winterpilz".
Osmostreß wurden alle Stadien des Lebenszyklus von Pleurotus ausgesetzt:
Kochsalz und Glycerol in sich entsprechenden Osmolalitäten beeinflußten hierbei das Wachstum des vegetativen Mycels in vergleichbarer Weise; P. ostreatus und P. pulmonarius zeigten keine signifikanten Toleranzunterschiede.
Optimal (höchste Geschwindigkeit und Gesamtproduktion) verlief das vegetative Wachstum bei umgerechnet etwa -O.9 MPa Substratwasserpotential; eingestellt wurde es zwischen -4,1 und -4,6 MPa. Als wasserstreßsensitivstes Lebensstadium war Fruchtkörperbildung von P. ostreatus bis S—l,8 MPa Substratwasserpotential möglich. Sporenkeimung, nicht aber die Ausbildung intakter Keimmycelien, wurde bei P. ostreatus noch bei -5,l MPa beobachtet; Dikaryen installierten sich bis ca. -2,7 MPa.
In summa zeigte Pleurotus also recht beeindruckende Osmotoleranz, die sich aber - bezüglich aller Lebensstadien - doch weitgehend innerhalb der "Norm" terrestrischer lignicoler Basidiomyceten bewegt.
Abschließend wurden Fruchtkörper verschiedener P. ostreatus- und P. pulmonarius- Stämme, die teilweise auf Kochsalz-angereicherten Medien und/oder unter Kälte- bis Frosteinwirkung gezogen worden waren, hinsichtlich ihres Gehalts an löslichen Koh- lenhydraten untersucht.
Der Gesamtanteil der gaschromatographisch identifizierten Polyole plus Trehalose belief sich auf durchschnittlich etwa 78% der isolierten "Neutralfraktion" = neutrale Kohlenhydrate ohne reduzierende Zucker; bis zu 28% der Trockenmasse!) und zeigte - innerhalb desselben Stammes - keine wesentliche Abhängigkeit von der Vorbehandlung der Kulturen. Gewichtsprozentig vorherrschend waren Trehalose und Mannitol: "Konstitutiv" (ohne Wasserhaushaltsbelastung) stellte dabei die Trehalose mit durchschnittlich 66% den weitaus größten Teil der Neutralfraktion (NF); unter intensiverer Kälteeinwirkung betrug sie sogar bis zu 77% NF . Bei zunehmender NaCl-Belastung des Kultursubstrats ging sie jedoch dramatisch zurück (minimal 16% NF) - und zwar zugunsten des Mannitols, welches von konstitutiv durchschnittlich etwa 8% bis auf maximal 62% NF anstieg. Der offensichtliche Abbau des Disaccharids Trehalose in je zwei Moleküle Mannitol darf wohl als osmoregulatorische Antwort auf mäßige bis stärkere Salzbelastung gewertet werden, während der ansonsten dominierenden Trehalose eine Rolle als Membranprotectans, insbesondere bei Frosteinwirkung, zukommen könnte.

In ecophysiological studies, the connections between water relations and sporulation of a fleshy basidiomycete, especially under water stress conditions, have been investigated. Two species of the genus Pleurotus, P. ostreatus and P. pulmonarius, both occurring in Central Europe, were chosen as test organisms. Both species are of economic importance as aggressive wood-destroying fungi on one hand and on the other hand, they are cultivated on a large scale as edible mushrooms.
1. Sporulation behaviour of the winter fungus Pleurotus ostreatus depending on climatic factors in the field were starting and reference point of the work.
Over long periods of time (weeks and months), temperature as well as water supply determine sporulation intensity. The contribution of both, however, varies according to season.
In winter especially, with the temperatures little exceeding the freezing point, temperature is the dominating variable. A rise in middle daily temperature enhances daily sporulation or allows a restart of sporulation after a harder frost period. Sporulation ceases below about -2.5°C. Under certain conditions, fruit-bodies of P. ostreatus are able to survive many days up to several weeks of frost (-l6°C minimum were recorded) and to sporulate again after thawing.
During milder periods (with temperatures exclusively above the freezing point), however, the water factor mainly determines the sporulation process. In this case, a more or less continuous sporulation activity of a fruit-body requires regular precipitations in form of rainfall or (with limited efficacy) dew. A high relative humidity alone is not sufficient.
The most extended sporulation period of a single sporocarp recorded in the field was more than four months. As a prerequisite for such a longevity of a non-leathery winter fungus, a remarkable degree of drought tolerance as well as of frost tolerance must be assumed.
Considering the daily pattern of sporulation, no endogenic rhythm could be found. Sporulation intensity is positively correlated with temperature only if plus and minus degrees alternate in the course of a day. During mild periods, the rise of temperature around midday often results in a dramatic decrease in relative humidity combined with a steep decline in sporulation intensity. As to daily sporulation pattern, relative humidity therefore plays the leading role.
Against this background of field data, further investigations were carried out under controlled conditions:
2. Sporulation behaviour of cultivated fruit-bodies of P. ostreatus and P. pulmonarius in relation to single as well as combined climatic factors
Diverse climatic stimuli (changes in temperature, relative humidity, light/dark), given single or in combination, were responded to in a principally identical way by both Pleurotus species.
In agreement with the indications from the field, an endogenic (e.g. circadian) rhythm can definitely be excluded.
Whereas the principal importance of a sufficiently high relative humidity for the duration of the sporulation period was confirmed by the laboratory experiments, a change in relative humidity during the course of the day did not influence sporulation intensity in any uniform way. This forms a complete contrast to the field data.
In non-extreme ranges (8 to 22°C), temperature is always positively correlated with sporulation intensity. A rise in temperature typically evokes an "overshooting" reaction.
Unexpectedly, light proved to act as a proper " killer factor" against sporulation in the laboratory. Alternating light and dark often resulted in a more or less complete depression of sporulation intensity in response to light onset.
3. Significance of the water factor for life expectancy and particularly sporulation course of a Pleurotus fruit-body
3.1. General water relations in a fruit-body
Mainly gravimetric investigations on the course of water loss, water absorption and water transport impressively confirmed the status of Pleurotus as a poikilohydric organism. Any protection against transpiration comparable to that of higher plants is inexistant. By exact measurements of water permeability, the cuticle of Pleurotus (and of several further basidiomycetes) was classified as a water "barrier" of a similar efficacy as tissue paper. Generally speaking, water relations are predominantly determined by purely physical phenomenons (e. g. evaporation, swelling, diffusion).
- On one hand, the evaporation of a sporocarp of Pleurotus is influenced by climatic conditions. In the same manner as that of a water-soaked physical body, it is, on the other hand, dependent on surface/volume ratio of the fruit-body. That is the reason why growth in tufts, acting as a sort of "passive" protection against evaporation, remarkably reduces the velocity of water loss as compared to solitary growth. Further, exposed to more severe drought, the lamellae show a remarkable ability to keep remaining water for a relatively long time by means of a more slanting and undulating arrangement.
- In a similar way, absorption and transport of water are predominantly subjected to physical laws. Consequently, the relatively extended cuticle absorbs available water with a considerably higher efficacy than the stipe with its rather small diameter. Apart from climatic variables, the ensuing water transport is mainly determined by morphology and anatomy (texture of hyphae) of the sporocarp.
- Water relations of a fruit-body are of particular interest in connection with the phenomenon of the so-called "revival". Sporulation of evaporating Pleurotus sporo- carps sometimes did not cease till their residual water content fell below 26% of their dry weight. A restart of sporulation, however, usually requires 300% of the dry weight at least. As a dry fruit-body cannot take up water more than 45% of its dry weight by an exclusive absorption of water vapour, the availability of liquid water is a prerequisite of a "revival" which may occur as early as 4-5 hours later, on an average.
3.2. Effect of water deficit (drought, frost and osmotic stress) on appearance and function of a fruit-body
By means of dew-point psychrometry, water and solute potential of diverse parts of fresh or dried-soaked fruit-bodies of P. ostreatus were determined. On principle, this method did not prove to be of unlimited suitability for measurements on fungal sporocarps. As an unequivocal result, however, the hymenophore of soaked sporocarps always showed clearly positive turgor potentials. This may be interpreted as an indication of vitality of at least a considerable percentage of the basidia and therefore indirectly of their drought tolerance.
Scanning electron microscopy was used to make visible the effect of frost of different duration and intensity on fresh fruit-bodies as well as on such which were air-dried for several months and partly soaked before preparation. Again sporophores demonstrated a remarkable ability to withstand drought and frost. Even the "hardest" frost treatment tested (-20°C for 28 h) was always tolerated by a certain part of the sterile hyphae or the hymenial elements. Particularly in the fresh fruit-bodies, the fully plasmatic younger basidia normally were little affected. Considering conditions in the field, this means for example that in winter sporulation can quickly restart when frosty weather is interrupted by a milder period.
Fluorescein-diacetate (FDA) was used to study vitality of water-stressed sporocarps. The artificially frozen samples of cultivated fruit-bodies of P. ostreatus clearly showed some, but a relatively scanty " vital fluorescence". In contrast, after having been exposed to a prolonged frost period, a sporocarp from the field was treated with FDA immediately after its collection. To a very considerable degree it consisted of living hyphae or hymenial elements in all its parts and so demonstrated its suitability as a winter fungus.
All the stages of the life cycle of Pleurotus were tested in respect to their reaction to osmotic stress.
Sodium chloride and glycerol in identical osmolalities influenced growth of vegetative mycelium in a comparable way. P. ostreatus and P. pulmonarius did not show any significant difference in their sensivity to reduced water potentials.
Vegetative growth was best (greatest velocity and highest total production) at a water potential of the substrate of about 0.9 MPa; it stopped between -4.1 and -4.6 MPa. Fruit-body formation of P. ostreatus, the stage of life most sensitive to water stress, was possible up to a water potential of s -1.8 MPa. Spore germination, but not formation of intact monocaryotic mycelium, was observed up to -2.7 MPa approximately.
In brief, Pleurotus therefore showed a rather impressive degree of osmotolerance which, however, is of a magnitude of order frequently found in terrestrial lignicolous basidiomycetes (with respect to all the stages of life).
Finally, fruit-bodies of diverse strains of P. ostreatus and P. pulmonarius cultivated on media. supplemented with sodium chloride and/or exposed to cold or frost were investigated with respect to their content in soluble carbohydrates.
Total percentage of polyols and trehalose identified by gas chromatography amounted to about 78% of the isolated "neutral fraction" (= neutral carbohydrates without reducing sugars; up to 28% of the dry weight). Considering one single strain, this value was not remarkably influenced by different pretreatments of the cultures. Trehalose and mannitol were found to be the most abundant compounds. "Constitutively" (without water stress), trehalose represented the greatest part of the neutral fraction (NF) with 66% NF on an average. After cold-treatment, trehalose content amounted up to 77% NF. With increasing sodium chloride concentration of culture substrate, it dramatically decreased (16% NF minimum), whereas the mannitol content rose from normally about 8% NF up to 62% NF (maximum). This obvious degradation of the disaccharide trehalose to two molecules of mannitol each may be interpreted as an osmoregulative answer to rising salinity. In contrast, the constitutively predominant trehalose may act as a membrane protectant, especially in the case of frost stress.