1 Einleitung 1
1.1 Was sind Endophyten? 1
1.1.1 Definition 1
1.1.2 Vorkommen 2
1.1.3 Bedeutung einer endophytischen Besiedelung 3
1.2 Taxonomie 4
1.2.1 Zur Morphologie und Physiologie von Pilzen 5
1.2.2 Pilzcharakterisierung mit molekularbiologischen Methoden 6
1.3 Ziel der Arbeit 7
2 Material und Methoden 8
2.1 Probennahme 8
1 2.1.1 Standorte 8
2.1.2 Materialgewinnung 8
2.2 Pilzisolierung 8
2.2.1 Epiphyten 8
2.2.2 Endophyten 9
2.2.2.1 Oberflächensterilisation 9
2.2.2.2 Überprüfung der Sterilisation 9
2.2.2.3 Vereinzelung 10
2.3 Stammhaltung und Referenzstämme 12
2.3.1 Stammhaltung für Mycelpilze 12
2.3.2 Stammhaltung für Hefepilze 12
2.3.3 Referenzstämme 12
2.4 Taxonomische Einordnung der Isolate 13
2.4.1 Sporulationsanregung bei Mycelpilzen 13
2.4.2 Mikroskopie 14
2.4.2.1 Färbungen und Lichtmikroskopie 14
2.4.2.1.1 Färbung mit milchsaurem Anilinblau 14
2.4.2.1.2 Färbung mit Trypanblau 14
2.4.2.2 Sekundärelektronenmikroskopie (SEM) 15
2.4.3 Morphologische und physiologische Untersuchungen 16
2.4.3.1 Charakterisierung von Hefepilzen 16
2.4.3.2 Identifizierung nach Barnett et al. (1990) 18
2.4.4 Molekularbiologische Untersuchungen 19
2.4.4.1 DNA-Extraktion 19
2.4.4.2 DNA-Gehaltsbestimmung 20
2.4.4.3 Gelelektrophorese und DNA-Qualität 20
2.4.4.4 PCR RFLP 20
2.4.4.4.1 PCR mit ITS Primern 21
2.4.4.4.2 Restriktionsverdau des ITS Amplikons 22
2.4.4.4.3 Fragmentlängen Polymorphismen 22
2.4.4.5 RAPD 25
2.4.4.5.1 PCR mit Zufallsprimern 25
2.4.4.a.2 Primerwirksamkeit 26
2.4.4.5.3 DNA Konzentration und Banden-
muster 27
5 Ähnlichkkeitsanalysen 27
2.6 Reinfektion 28
2.6.1 Anzucht axenischer Kleepflanzen 28
2.6.2 Infektionen 30
2.6.3 Reisolierung 31
2.7 Nachweis endophytischer Pilze im Blatt 31
2.7.1 Epidermispräparation 31
2.7.2 Gewebedünnschnitte 31
2.7.3 Apoplastenflüssigkeit 32
2.7.4 Fluoreszenzfärbungen 32
2.7.4.1 Calcofluor 33
2.7.4.2 DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol) 33
2.7.4.3 FDA (Fluoresccindiacetat) 33
2.7.4.4 Anilinblau, basisch 34
3 Ergebnisse 35
3.1 Isolierte Epiphyten 3a
3.2 Isolierte Endophyten 3a
3.3 Identifizierung der Endophyten 37
3.3.1 Endophytische Mycelpilze 37
3.3.2 Morphologie endophytischer Hefepilze 40
3.3.3 Wachstumseigenschaften getesteter Hefepilze 41
3.3.4 Ähnlichkeitsanalysen mit Wachstumseigenschaften 48
3.3.5 PCR Techniken 51
3.3.a.1 DNA-Extraktion und DNA-Qualität 51
3.3.5.2 PCR-RFLP 53
3.3.a.2.1 Gelelektrophorese und Auswertung 53
3.3.5.2.2 Muster mittels Restriktionsenzymen 54
3.3.5.2.3 Ähnlichkeitsanalysen 58
3.3.5.3 Kombination physio und molekularbiologischer Daten 62
3.3.5.4 RAPD 67
3.3..5.4.1 Primerwirksamkeit / DNA-Quantität 67
3.3.a.4.2 DNA-Amplifizierung 67
3.3.5.4.3 Suche nach identischen Isolaten 68

3.4 Reinfektion 70
3.4.1 Axenische Kleepflanzen 71
3.4.2 Reisolierte Pilzstämme 71
3.5 Nachweis von Endophyten im Weißklee 72
3.5.1 Endophyten in Apoplastenflüssigkeit 72
3.5.2 Durchlichtmikroskopischer Nachweis 73
3.5.2.1 Anilinblaufärbung 73
3.5.2.2 Epidermispräparation 73
3.5.2.3 Gewebedünnschnitte 73
3.5.3 Fluoreszenzmikroskopischer Nachweis 74
3.5.3.1 DAPI 74
3.5.3.2 FDA 74
3.5.3.3 Basisches Anilinblau 75
4 Diskussion 80
4.1 Zur Isolierbarkeit von Endophyten 80
4.2 Identifizieren von Endophyten und ihre Rolle im Wirt 83
4.2.1 Epiphyt, Pathogen, Endophyt? 83
4.2.2 Mycelpilze 84
4.2.3 Hefepilze 86
4.3 Taxonomie endophytischer Hefen 89
4.3.1 Einordnung nach morpho- und physiologischen Merkmalen 90
4.3.2 Einordnung nach molekularen Merkmalen 93
4.3.2.1 PCR-RFLP 94
4.3.2.2 RAPD 97
4.3.3 Klassik und Moderne kombiniert 99
4.4 Nachweise, Endophyten im Pflanzeninneren 103
4.4.1 Wie gelangen Hefen in Pflanzen? 104
4.4.2 Mikroskopie 105
4.5 Ausblick 108
5 Zusammenfassung 110
6 Summary 112
Literaturverzeichnis 114
A Anhang 132
A.1 Lösungen und Medien 132
A.1.1 Reaktionslösungen 132
A.1.1.1 Pufferlösungen 132
A.1.1.2 Farbstofflösungen 133
A.1.1.3 Weitere Lösungen 134
A.1.2 Nährmedien 135
A.2 Physiologische Merkmale für Referenzstämme 138
Index 141