Danksagung VII
Abkürzungen VIII
1 Einleitung 1
1.1 Von der Epidemie zur Agrochemikalie 1
1.2 Die systematische Stellung von Gibberella fujikuroi 2
1.3 Die Gibberelline 3
1.4 Die Gibberellin-Biosynthese 4
1.4.1 Phase I: Der Isoprenoid-Biosyntheseweg und die Bildung
von ent-Kauren 4
1.4.2 Phase II: Vom ent-Kauren zum GA12-Aldehyd 6
1.4.3 Phase III: Die Synthese biologisch aktiver Gibberelline 7
1.4.4 Kompartimentierung und Regulation der Gibberellin-Biosynthese 8
1.4.5 Deaktivierung der Gibberelline 10
1.5 Wege zur Isolierung von an der Gibberellin-Biosynthese
beteiligter Gene 10
1.6 Das "Gencluster" der Gibberellin-Biosynthese bei
G. fujikuroi 12
1.7 Zielsetzung der Arbeit 13
2 Material und Methoden 14
2.1 Stämme 14
2.1.1 Escherichia coli 14
2.1.2 Gibberella fujikuroi 14
2.1.3 Oryza sativa 14
2.2 Plasmide 14
2.3 Primer 15
2.3.1 Sequenzierungs-Primer 15
2.3.2 Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Primer 15
2.4 Chemikalien 15
2.5 Enzyme 16
2.6 Medien 16
2.7 Molekulargenetische Arbeitsmethoden 17
2.7.1 Präparation von Nukleinsäuren 17
2.7.1.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 17
2.7.1.2 Isolierung von DNA aus lambda-Phagen 17
2.7.1.3 Isolierung von genomischer DNA aus G. fujikuroi 17
2.7.1.4 RNA-Isolierung 18
2.7.2 Gelelektrophorese und Restriktion von Nukleinsäuren 18
2.7.2.1 Restriktion und Gelelektrophorese von DNA 18
2.7.2.2 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 19
2.7.2.3 RNA-Gelelektrophorese 19
2.7.2.4 Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) 19
2.7.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 20
2.7.3.1 PCR mit genomischer DNA 20
2.7.3.2 RT-PCR 21
2.7.4 Transfer von Nukleinsäuren 21
2.7.4.1 Southern-Blot 21
2.7.4.2 Koloniefilter 21
2.7.4.3 Phagenplaquefilter 22
2.7.4.4 Northern Blot 22
2.7.5 Hybridisierung 22
2.7.5.1 Sondenvorbereitung 22
2.7.5.2 DNA/DNA-Hybridisierung 23
2.7.5.3 DNA/RNA-Hybridisierung 23
2.7.6 Sequenzierung von DNA 23
2.7.7 Transformation von E. coli 24
2.7.7.1 Klonierung von DNA-Fragmenten 24
2.7.7.2 "In vivo Excision" von lambda-Uni-ZAP XR-Klonen 24
2.7.8 TransLormation von G. fuLikurOi 24
2.8 Dünnschichtchromatographie (DC) 25
2.9 "High Pressure Liquid Chromatographie" (HPLC) 26
2.10 Reis-Biotest 26
Ergebnisse 27
3.1 Erzeugung und Analyse von Transformanten mit Störungen
in der Gibberellin-Biosynthese 27
3.1.1 TransLormation von G. fuLiFuroi mit pAN7- 1 27
3.1.2 Bestimmung der Phänotypen der Transformanten 28
3.1.3 Analyse der Vektorintegrationen in den gib-Stämmen 30
3.1.4 Southern-Analyse der gib-Stämme 32
3.1.5 Chromosomenanalyse 35
3.1.5.1 Pulsfeld-Gelelektrophorese 35
3.1.5.2 Erstellung einer Chromosomenkarte 36
3.2 Sequenzanalyse flankierender Bereiche des "Genclusters"
der Gibberellin-Biosynthese 40
3.2.1 Subklonierung und Sequenzierung der 3'-Bereiche von orf 3 40
3.2.2 Das Aldehyddehydrogenase-Gen 41
3.2.3 Das Alkoholdehydrogenase-Gen 46
3.2.4 Das Ankyrindomänen-Gen 50
3.2.5 Das Membrantransporter-Gen 53
3.2.6 Ermittlung der cDNA-Sequenzen 56
3.2.7 Transkriptnachweise 57
3.3 Inaktivierung des smt-Gens durch "Gene Disruption" 59
3.3.1 Konstruktion des "Gene Disruption"-Vektors 59
3.3.2 Transformation von G. fujikuroi mit pSMTAUS 59
3.3.3 Analyse der Transformanten 62
3.4 "Chromosome Walking" 63
4 Diskussion 64
4.1 Deletionen des "Genclusters" der Gibberellin-Biosynthese 64
4.2 Die Suche nach weiteren Genen des "Genclusters"
der Gibberellin-Biosynthese 69
4.2.1 Das Aldehyddehydrogenase-Gen 69
4.2.2 Das Alkoholdehydrogenase-Gen 73
4.2.3 Das Ankyrindomänen-Gen 77
4.2.4 Das Membrantransporter-Gen 78
4.2.5 Zusammenfassende Abschätzung 81
5 Zusammenfassung 84
6 Summary 85
7 Literatur 86
8 Anhang 101